date：2021-10-14
author：余顺太
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5' arm的生成

下载该基因的序列

5KoxaV.png

以genomic DNA为模板，通过PCR从其上面 P下来5' arm，同时在5' arm两端加上SalI和HindIII的酶切位点，引物，引物Tm值，产物大小，PCR条件如下：

Prrc2c-SalI-F:  ACGCgtcgaCACAAAAGCCAAGGATGGGAAGAAG          15779  67.0  1242bp
Prrc2c-HindIII-R: GATaagcttcggtcgtCCCCTTAACTTCTAAATATGGAACACT    17020  60.8
98℃ 10sec  60℃25sec  72℃50sec    37cycles

3' arm的生成

以genomic DNA为模板，通过PCR从其上面 P下来3' arm，同时在3' arm两端加上BamHIa和NotI的酶切位点，引物，引物Tm值，产物大小，PCR条件如下：

Prrc2c-BamHI-F: GATggatccgctacgACTGCCTCCTCTCCCACCCTGTTC         17994  68.8  1381bp
Prrc2c-NotI-R:  GGAAAAgcggccgcACAGGCCATGTCTGTTGTTCCTTAATTC    19374  67.2
98℃ 10sec  66℃25sec  72℃50sec    37cycles

target exon两端加上loxp

target exon sequence两端加上loxp分成两轮PCR反应来进行：

 第一轮PCR反应：以genomic DNA为模板，通过 Prrc2c-HindIII-loxp1-F1 和 Prrc2c-BamHI-loxp2-R1 引物对进行PCR扩增，使target gene一端带上loxp1的部分序列，另一端带上loxp2的部分序列（之所以只带上loxp部分序列而没有全部带上，是因为如果带上全部loxp序列，再加上binding在genomic DNA上面的序列，引物将会巨长，超长引物会导致与之相匹配的退火温度以及延伸温度增加，若该温度超过了DNA聚合酶的最佳延伸温度，则产物特异性会很差。同时引物太长合成亦不方便，成本更高。所以只带上部分loxp序列，loxp剩下的部分再通过第二轮PCR带上）；

Prrc2c-HindIII-loxp1-F1: TGTATGCTATACGAAGTTATcgagaCAACATGAAGCTATTTTCCCACTTTCAC 16849  66.0
Prrc2c-BamHI-loxp2-R1: CATACATTATACGAAGTTATggcgtcGGTACAGGCTATGCAGTGTAAGTAAACCTG  17991  66.6
98℃ 10sec  64℃25sec  72℃40sec    37cycles                

genomic DNA 和 loxp1之间的 cgaga 以及genomic DNA 和 loxp2之间的 ggcgtc 主要有两个作用；第一个目的是破坏sgRNA在目的产物中的结合位点；还有一个作用就是通过引入外源碱基，增加GC含量，使之与screen鉴定引物更加高度匹配，且结合更强。如下图所示，如果没有 ggcgtc 则 T7-prrc2c-18006r-gRNA-F会与目的产物中loxp和的target exon之间的结合部分进行binding，进而对我们的目的产物进行切割，这是我们不想看到的，但是ggcgtc的存在使该位置的序列和sgRNA不再匹配，成功避免了目的产物被sgRNA切割的命运。（这只是我自己认为的，因为 Prrc2c-HindIII-loxp1-F1 引物中的 ggcgtc这样解释不通。 ）

 第二轮PCR反应：以第一轮PCR反应的产物为模板，通过 Prrc2c-HindIII-loxp1-F2 和 Prrc2c-BamHI-loxp2-R2 引物对进行PCR扩增，此次PCR反应使 target exon sequence 一端带上完整 loxp1 序列和Hind III酶切位点，另一端带上完整 loxp2 序列和BamHI酶切位点 。

Prrc2c-HindIII-loxp1-F2: GATaagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATcgagaCAACA
Prrc2c-BamHI-loxp2-R2: GATggatccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATggcgtcGGTAC

经过以上的两轮PCR反应，target exon两端加上loxp生成如下图所示的Part II。然后如图中所示：5' arm（即Part I），Part II，3' arm（即Part III）连接起来，形成一个整体，我们将其命名为recombinant nucleotide，将其与两个sgRNA（分别是T7-prrc2c-16867r-gRNA-F 和 T7-prrc2c-18006r-gRNA-F）和 Cas9蛋白一起注射进胚胎，两个 sgRNA 起 GPS 定位功能，而Cas9蛋白去进行切割，将这两个sgRNA的序列mapping回genomic DNA可以看到中间夹的是第3个外显子（如红箭头所示），在Snapgene上可以看到该外显子碱基个数为178bp，该178bp不能被3整除，Cre-loxp生效使之切掉之后会发生移码突变，导致基因失效。这两个sgRNA的信息如下：

T7-prrc2c-16867r-gRNA-F: TTAATACGACTCACTATAggaaaatagcttcatgttggGTTTTAGAGCTAGAAATAG
T7-prrc2c-18006r-gRNA-F: TTAATACGACTCACTATAggagaggaggcagtatggtacGTTTTAGAGCTAGAAATAG

5M6xBD.png

5MEAOA.png

被两个loxp夹住的外显子被sgRNA切掉之后，中间产生一个缺口，recombinant nucleotide的5' arm和缺口左端同源，recombinant nucleotide的3' arm和缺口右端同源，然后同源重组，recombinant nucleotide就进入到了genomic DNA里面，这就获得了flox小鼠。

小鼠基因型鉴定

鉴定loxp1的引物，下面这对引物都是binding在genomic DNA上面，loxp1位于这对引物的中间，

Prrc2c-16867r-seq-F:  TCCACAATGATAACACTTCCTCCAACAG     16715 66.8 322bp
Prrc2c-16867r-seq-R： AACCCACCCACCAGAACCCCTT           17036 67.5

鉴定loxp2的引物，下面这对引物都是binding在genomic DNA上面，loxp2位于这对引物的中间，

Prrc2c-18006r-seq-F:  TGAGTTCAGTAGCATTAGCCATAAGCACAG   17912  67.8  217bp
Prrc2c-18006r-seq-R:  GCATCTTGGAATTTAGGCAACAGAACC      18128  67.7  
```

最开始的一两代小鼠要用screen引物进行鉴定，这样可以P出大片段，准确确定插入正确性，黑粗碱基是与前面讨论的 cgaga 和 ggcgtc 对应的。

Prrc2c-CKO-screen-nF1: ATAGAGAGAGGCGGAGGGGGCTT 15390 67.8
Prrc2c-CKO-screen-nR1: AGTGGGAAAATAGCTTCATGTTGTCTCG 16871 67.5 1482bp
Prrc2c-CKO-screen-R2: GGTGGGAGAGGAGGCAGTCGTAGC 18011 69.4 2621bp

Prrc2c-CKO-screen-nF3: TGGATCAGGCCAGCCTCATTGTC 16832 69.3 2637bp
Prrc2C-CKO-screen-F4: CACTGCATAGCCTGTACCGACGCC 17974 68.2 1495bp
Prrc2c-CKO-screen-R3: TAGGAGGATTTCTGTAAAAGACATTTGGGA 19468 67.4

image.png

转基因小鼠F0的制作

1. 制备原核显微注射的DNA。DNA的纯度和浓度对后续的成功率影响较大。
2. 同步获得供体雌鼠（注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得）和假孕受体母鼠（正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。供体鼠用于收集注射用受精卵，而假孕受体母鼠用于孕育注射后存活的受精卵，最后产出F0代转基因小鼠。
3. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。工作液中受精卵可能成团状，显微注射用的受精卵必须是单个细胞，而且无细胞碎片。如不符合该标准，需用透明质酸酶进行消化，随后漂洗干净。
4. 受精卵鉴定 ，将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管(或子宫)内，饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。
5. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部小鼠的20％-30％。因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。较常用的鉴定基因是否整合的方法有PCR法及Southern杂交法。而Northern杂交，RT-PCR检测，Western杂交，免疫组织化学法则被用来检测转入基因的蛋白表达状况。

转基因小鼠F0的鉴定

F0阳性率比较低，100个里面可能只有五六个是阳性的。我们通过剪脚趾然后PCR鉴定，鉴定结果正确的，对PCR产物进行测序来确定。（我之前认为将F0雄性养大，然后将F0与WT雌鼠交配，杀雌鼠从子宫中取精子，然后鉴定也可以。可是雄性小鼠一次可以产生很多精子，并不是单个的，这么多精子基因型不不一样，所以无法通过精子确定。）

将F0的F/+与WT交配获得F1

为什么要将F0与WT杂交而不是将F0直接杂交获得纯合小鼠?
（1）因为F0代小鼠通常是嵌合体，这意味着它们的不同细胞群体可能携带不同的基因编辑结果。在F0代直接杂交时，后代可能携带各种复杂的基因型，不利于稳定的遗传和后续的分析。与WT小鼠杂交可以更清楚地观察编辑是否成功，并筛选出携带期望基因编辑的个体。
（2）将F0代与WT杂交有助于通过标准化流程逐步筛选出稳定遗传的编辑基因型。直接让F0代相互交配，得到的后代可能携带各种不同的突变，导致后续分析和表型解释更加复杂和不可控。

将同基因型的F1雌性与雄性交配获得Hom的F2

Q：如何才能确定F1代互交时雄性和雌性小鼠的Flox位点或KO位点位于同一位置？如果只是测F0脚趾的PCR产物？而该F0小鼠恰恰又是嵌合，也就是说如果F0的脚趾鉴定Flox位点或KO位点在A处，而F0产生的配子Flox位点或KO位点有的在A处，有的在B处，有的在C处，那么F1互交的时候恰恰又是B处和C处的交配最后产生的F2是一个等位基因在B处，一个等位基因在C处岂不很尴尬？

Answer： F1代小鼠来自单个受精卵，因此不可能出现像F0代那样的嵌合体现象，PCR进行鉴定即可，如果编辑位点不一致，PCR可以确定出来。flox是同源重组得到的，有固定位置，PCR可以鉴定到。KO小鼠因为损伤修复会有不一样的条带。但是对于mut小鼠，还是会对F1进行测序鉴定的，因为单个一个氨基酸突变，PCR不太好确定。

F0从注射到出生20天，再到性成熟又两个月，F1从受精卵形成到性成熟又要两个月加20天，F2从受精卵发育到出生又要20天，也就是拿到F2代需要半年