蛋白纯化的步骤一般包括哪些？

根据外源基因在宿主细胞中表达方式的差别以及表达蛋白本身的特性，重组蛋白的分离 纯化工艺各不相同。但无论什么蛋白产品， 一般都包括对发酵液进行预处理、回收菌体、细 胞破碎、离心分离、样品的浓缩与预处理、柱层析和电泳等步骤。在分离过程中，为保证蛋 白质的生物活性， 一般在低温条件下操作，提取的条件也要尽量保持温和。分离纯化方法的 选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数和回收 率；纯化步骤间要能直接衔接，不需要对物料进行处理或调整，这样可以减少工艺步骤，节 约时间，降低成本，提高生产效率。

1.发酵液的预处理

对发酵液进行预处理有助于后面的操作过程，可以达到以下目的：改变发酵液的物理性 质，提高固液分离效率；转移产物至后续处理的相中；除去部分杂质，简化后续工艺。

发酵液的预处理内容主要包括改变发酵液物理性状(如加热、调节 pH 值、絮凝等)以 及改善固液分离特性(通过过滤等方法实现固液分离)两类方法，根据被分离物质的性质可 选择某一种或者其中的几种方法相结合使用。

2.细胞分离

通过原核细胞培养获得的培养液，无论目标蛋白位于细胞内还是被分泌到细胞外的培养 基中，首先都应该将细胞与培养液进行分离， 一般通过离心沉降或者过滤的方式进行分离。

3.细胞破碎

对于在胞内表达的蛋白质，将细胞与液态相分离后，就要考虑将细胞破碎，以使目标蛋 白质从胞内释放到提取液中，然后进行目的产物的纯化。因此，细胞破碎效果对胞内蛋白质 的分离纯化是非常重要的。

常用的细胞破碎方法包括物理法、化学法和生物方法，破碎细胞壁和细胞膜，从而将胞 内物质释放到提取液中。针对不同的细胞种类和细胞的不同生长状态，可选择适当的破碎方 法。常见的破碎方法有变性剂裂解法、超声波破碎法、机械破碎法、酶解法和反复冻融法。

4. 离心分离

离心是基因表达产物分离纯化的重要步骤，包括高速离心和超速离心。高速离心的离心 力一般在10000g的范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等。经过高速离心 后细胞膜碎片和细胞内的可溶性蛋白等主要存在于上清液中。如果基因表达产物是小分子可 溶性蛋白，还可以进行超速离心(100000g以上)以除去细胞膜碎片等杂质。

5.柱层析

根据蛋白质的不同用途，需要对表达的特异性蛋白质进行进一步的分离纯化，而柱层析 技术是蛋白质分离纯化的重要手段。层析法又称色谱法 (chromatography), 它包括凝胶过 滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、吸附层析、金属螯合层析以及共价层析等。 尽管层析的方法多种多样，但基本的原理却是一致的。所有的层析系统都是由互不相溶的两 相组成， 一个是固定相即层析介质，另一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异(如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等),使各组分以不 同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，最终彼此完全分开。

6.电泳

电泳不仅是检测蛋白质的重要手段，在实验室也可以作为少量制备或纯化蛋白质的方 法。蛋白质电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。PAGE 可分为 Native-PAGE 和 SDS-PAGE 两种，前者主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化，后者则用于可通过变 性的方法作进一步纯化的特异性表达蛋白。通过柱层析获得的特异性表达蛋白经PAGE 、转 膜和洗脱后，可以获得电泳纯的样品。该电泳纯的样品可用来进行氨基酸序列分析、免疫学 分析和医学研究等。