一步法荧光定量试剂盒的选择标准

实时荧光定量（RT-qPCR）想必大家都不陌生，根据其实验步骤的不同，可以分为“一步法”与“两步法”。目前来说，两步法研究者用的比较多，即是将反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。这种方法的最大优点是可以保存反转录后的cDNA产物，但对于需要对大量样品进行分析或定量PCR，又或是对防污染要求比较高的研究者来说是不适用的，而一步法RT-qPCR就很好的解决了这类实验难题。

简单来说，一步法荧光定量就是逆转录和定量PCR在一个反应管内一步完成，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应，整体实验操作简便，非常适合于研究生使用。目前，除了像Thermo Fisher此类国际生物试剂品牌，国内的像BIOG也有用下来不错的一步法荧光定量试剂盒，这些试剂普遍具有以下几个特点:

1、操作简单

加样环节少，两步反应都在一个管中完成，这种方法能克隆微量mRNA 而不需构建 cDNA 文库，省略了cDNA与qPCR反应之间体系转换的过程，操作方便快捷，也大大提高了实验的效率，非常适用于高通量扩增/筛选；

2、减少污染

cDNA合成和扩增之间不需要打开反应管盖，更少的移液步骤能够减少污染的风险，同时具有更少的实验误差；

3、灵敏度更高

一步法反转录得到的所有cDNA都用来扩增，所以相比于两步法来说灵敏度更高，可高出10倍，且最低可检测到1 pg总RNA中的目标片段，有些两步法无法检测到的数据，用一步法可以检出。

此外，我们还购买了一款国产品牌的一步法RT-qPCR试剂盒与BIOG的进行了比较，结果如下图所示，从扩增曲线结果来看，BIOG一步染料法荧光定量PCR试剂盒反应更为灵敏，线性范围宽，稳定性好。