- 皮肤炎症激活肠道基质成纤维细胞并促进结肠炎 - PMC

摘要

皮肤炎症性疾病经常与炎症性肠病（IBD）相关联。为了探索这些器官之间的通讯机制，我们对患有IBD的人类和小鼠的成纤维细胞进行了单细胞RNA测序分析。这项分析揭示了肠道炎症促进了一部分肠道基质成纤维细胞分化为具有先天抗菌宿主防御活动的前脂肪细胞。此外，如果小鼠皮肤因受伤或感染而发炎，这种反应性脂肪生成过程会加剧。由于透明质酸（HA）的分解在皮肤受伤期间被激活，而成纤维细胞向脂肪细胞的分化依赖于HA，我们测试了HA片段可以通过在小鼠皮肤基底角质形成细胞中靶向表达人类透明质酸酶-1来改变结肠成纤维细胞功能的假设。皮肤中透明质酸酶的表达激活了肠道基质成纤维细胞，改变了粪便微生物组，并在用硫酸葡聚糖挑战后促进了过度的反应性脂肪生成和结肠炎症的增加。对消化HA的反应依赖于前脂肪细胞表达的TLR4。总的来说，这些结果表明，皮肤炎症与IBD之间的关联可能是由于结肠的间充质成纤维细胞识别在皮肤炎症期间释放的HA

介绍

所有人类上皮表面都使用先天宿主防御系统来检测并适当应对环境挑战，例如物理损伤和细菌入侵。皮肤和肠道通过不同的先天免疫策略来应对截然不同的环境，以防御独特的病原体。然而，尽管存在差异，但这些关键屏障器官的炎症性疾病经常同时观察到 ( 1 – 4 )。例如，患有炎症性肠病（IBD）的患者患炎症性皮肤病的风险较高（5），而患有原发性皮肤病的患者患IBD的风险也较高（6））。这些观察结果导致人们推测这些上皮表面之间发生了通讯，这种现象在哮喘、食物过敏和特应性皮炎中也观察到了（7）。尽管造成这种免疫串扰的机制在很大程度上仍不清楚，但据推测，上皮器官之间存在信号，导致远处上皮表面的免疫稳态被破坏。

宿主对皮肤和肠道的防御涉及多个系统，其中包括经典免疫细胞以及先天抗菌效应分子的作用 ( 8 )。最近的研究表明，皮肤真皮和肠道粘膜下层中的异质成纤维细胞群有助于免疫防御 ( 9 – 12 )。这些分子支持免疫细胞的发育，并在局部损伤或感染触发它们进行脂肪形成分化时提供先天的免疫保护功能。前脂肪细胞成纤维细胞 (pAD) 的后者防御功能不同于成熟脂肪细胞 (AD) 的作用，后者具有独立的炎症促进功能 ( 13，14）。长期以来，前脂肪细胞成熟过程在 IBD 中被观察为“脂肪蠕变”现象，但前脂肪细胞作为免疫成纤维细胞 (IFC) 在宿主结肠防御中的作用尚不清楚。

pAD 向 AD 的分化取决于细胞外基质中透明质酸 (HA) 的存在 ( 15 , 16 )。 HA 具有多种免疫调节功能 ( 17 – 19 )。为了应对炎症，HA 被消化成低分子量片段，作为损伤相关分子模式具有独特的免疫活性（DAMP；参考文献20 – 22）。在这项研究中，我们试图了解成纤维细胞是否参与 IBD 的发病机制，以及 HA 是否可以作为皮肤的信号，通过影响脂肪细胞分化来改变肠道免疫功能。我们的观察提供了证据，促进了对皮肤和肠道疾病关联背后的病理生理学的理解。

结果

1 挖掘IBD单细胞数据，说明亚群的脂肪分化情况 （细胞外基质形成的基因表达减少，这个观点那篇真菌的也提了）

为了开始评估成纤维细胞在炎症性肠病 (IBD) 中的潜在作用，我们重新分析了目前可用的来自健康个体和新诊断的溃疡性结肠炎 (UC) 患者结肠的单细胞 RNA 测序 (scRNA-Seq) 数据（Gene表达综合 [GEO] 数据库 GSE95459 和 GSE114374）。根据血小板衍生生长因子受体 α (PDGFRA) 的表达对基质成纤维细胞的转录反应进行询问。来自这些供体的 PDGFRA 阳性基质成纤维细胞被分为 5 个不同的群体（图1A）。 UC 患者的组 2a 和 4 增加，组 1 和 3 减少（图 1、B 和 C）。基因个体发育（GO）分析显示，UC患者的结肠成纤维细胞中参与脂肪细胞分化和炎症的基因表达增加，而参与细胞外基质形成的基因表达减少。图1、D和E）。这些结果表明，结肠成纤维细胞前脂肪细胞亚群的扩张与 UC 相关，这一发现与克罗恩病 (CD) 肉眼检查中临床观察到的发炎肠道周围肠系膜脂肪组织扩张一致，称为蠕动脂肪 ( 4 , 10 ) 。此外，这种成纤维细胞分化为脂肪的过程（反应性脂肪生成）也已被证明发生在小鼠中，以响应右旋糖酐硫酸钠 (DSS) 造成的肠道损伤，或发生在金黄色葡萄球菌感染后的皮肤中( 23 , 24）。这种反应对于免疫防御是必要的，因为抑制成纤维细胞分化为脂肪细胞会降低抗菌免疫防御并增加细菌渗透。因此，在这些 IBD 个体中观察到的反应性脂肪生成过程很可能是 IFC 子集分化为脂肪细胞的结果，该子集有助于结肠的防御环境。

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2 皮肤损伤加重DSS诱导的IBD模型肠道的炎症水平

接下来，我们研究了局部皮肤炎症是否会影响小鼠的结肠，从而可能模拟皮肤和肠道疾病的人类临床关联。为了测试这一点，我们评估了两种不同形式的小鼠皮肤损伤：全层无菌切口损伤 ( 25 ) 和皮内注射金黄色葡萄球菌感染( 12 )。皮肤受伤 48 小时后，饮用水中添加 DSS 会损伤肠道 ( 26 )。与对照小鼠相比，有皮肤伤口的小鼠对 DSS 的反应显示肠道疾病严重程度增加，体重下降幅度更大，并且在 DSS 撤除后恢复延迟。图2A）。与此一致的是，有皮肤伤口的小鼠结肠组织中的Il6表达也更高（图2B）。与没有皮肤损伤的小鼠相比，小鼠结肠中的脂联素 ( Adipoq) mRNA 也有所增加。图2C），这一发现与皮肤受伤后结肠中脂肪生成的增加一致。在患有另一种皮肤炎症的小鼠中观察到结肠中的类似反应。患有金黄色葡萄球菌皮肤感染的小鼠在 DSS 治疗后表现出更大的体重减轻和结肠中Il6和Adipoq mRNA 的更高水平。图 2，D–F）。

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为了进一步确定皮肤损伤如何影响肠粘膜下细胞的功能，我们接下来对皮肤受伤后从小鼠结肠分离的成纤维细胞进行了 scRNA 测序。为了关注皮肤炎症的影响，我们在没有结肠炎的情况下进行了这项分析。来自结肠的PDGFRA ^{+基质成纤维细胞在所有小鼠的多个细胞簇中都是可区分的（}图3A）。从有和没有皮肤伤口的小鼠中分离出这些细胞簇的比较表明，这些细胞簇内的细胞分布在皮肤损伤后是不同的。图3B）。特别是，有皮肤伤口的小鼠显示，被识别为簇 5 的肠道成纤维细胞增加，而被识别为属于簇 0、2 和 7 的细胞减少（图3C）。对皮肤伤口小鼠样本中所有成纤维细胞的 GO 分析表明，伤口导致与促炎反应和脂肪细胞分化相关的转录物表达增加，以及与细胞外基质维持相关的转录物的丢失。图3D）。对簇 5 中基因的重点 GO 分析表明，该子集包括与脂肪细胞分化相关的基因（图3E）。伪时间分析（27）区分了成纤维细胞群体中的3个谱系以及每个谱系的几个特征基因的表达（图3、F和G）。最值得注意的是，在皮肤受伤后，我们观察到具有与脂肪细胞分化相关基因最多的成纤维细胞在谱系 3 中从簇 2 转移到簇 5（图3H）。除了簇 5 中发现的 5 个最丰富的基因之外，在该子集中还检测到了CCAAT 增强子结合蛋白 β ( Cebpb )（图3I](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8553570/figure/F3/)）。该转录因子对于抗菌素抗菌肽 ( Camp ) 的表达至关重要，并且是反应性脂肪生成过程中表达的特征基因 ( 12 , 28 )。总体而言，对结肠粘膜下成纤维细胞转录反应的分析表明，皮肤损伤触发了粘膜下成纤维细胞群落第5簇中的细胞向更促炎和成脂的状态发展。

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3 转录因子Zfp423

Zfp423 在脂肪生成开始后在成纤维细胞中表达 ( 29 )。为了独立证实皮肤损伤可以促进结肠中的反应性脂肪生成，我们对 Zfp423 ^lacZ/+报告小鼠 ( 30 ) 进行皮肤损伤和 DSS 攻击。用 β-gal 观察 lacZ 表达表明，皮肤受伤导致远端结肠和间充质脂肪中 Zfp423 表达增加。图3、J和K）。这些数据与Adipoq mRNA表达增加以及皮肤受伤和 DSS 攻击后结肠中脂肪层扩张增加的组织学证据一致，如图 2 所示。这些结果证实皮肤损伤增加了 DSS 促进脂肪生成的能力在结肠中。

接下来，我们在另一种小鼠结肠炎模型中检查了皮肤损伤的影响，该小鼠结肠炎模型是由自发性自身免疫炎症驱动的，这种炎症在Il10缺陷 (IL10 ^–/– ) 小鼠中观察到。皮肤受伤后 48 小时，与没有皮肤损伤的 IL10 ^{–/–小鼠相比，有皮肤伤口的 IL10 –/–}小鼠结肠疾病严重程度更高（图 4，A 和 B）。Cebpb表达增加（图4C）和前脂肪细胞分泌因子 1 阳性（Pref1 阳性）细胞数量的增加作为早期脂肪生成的指标（参考文献31和图4D）也被观察到。这些结果表明，反应性脂肪生成也可能发生在 IL10 ^-/-小鼠的结肠中，并且皮肤受伤会加剧该模型中的结肠炎。

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4 光转换 (KikGR) 小鼠证明皮肤损伤对肠道的影响，不是皮肤周围的细胞迁移的结果

为了确定为什么结肠粘膜下成纤维细胞可以检测到皮肤损伤，我们评估了活化的免疫细胞从皮肤到结肠的运输。为了评估这一点，我们使用了光转换 (KikGR) 小鼠，在 435 nm 的高强度紫光照射下，所有细胞都可以被诱导从绿色荧光变为红色荧光 ( 32 , 33 )。对小鼠进行局部照射，将皮肤中的所有细胞标记为红色，然后像之前的实验中那样对小鼠进行皮肤损伤。皮肤损伤后 48 小时，通过 FACS 分析评估结肠中是否存在来自皮肤的 KikRed 细胞（补充图 1、A 和 B；可与本文一起在线获取补充材料；https://doi.org/10.1172/JCI147614DS1）。光转换后，我们在皮肤中检测到大量的 KikRed 细胞，但在皮肤损伤后 2 天或患有结肠炎的受伤小鼠中，没有看到 KikRed 细胞从皮肤迁移到结肠的证据（补充图 1C）。

5 透明质酸促进了反应性脂肪生成

HA 对于前脂肪细胞的发育是必需的( 9,34,35 )。 HA 是皮肤细胞外基质的主要成分 ( 36 , 37 )，受伤或感染后会在皮肤中降解，从内源性高分子量形式 (HMW-HA) 转化为可溶性低分子形式。重量片段（LMW-HA；参考号18、35）。我们假设从皮肤释放 LMW-HA 片段可以增强结肠中基质成纤维细胞的脂肪形成反应。为了首先测试这种现象是否可以在体外发生，我们从培养的过表达人透明质酸酶-1 (hHYAL1) 的原代小鼠成纤维细胞 (mFB) 中分离出 LMW-HA，并通过分化为脂肪细胞来诱导增加 HA 合成 ( 35 )。分化过程中合成的 HMW-HA (500–1000 kDa) 被 hHYAL1 消化为 LMW-HA (6.8–250 kDa；补充图 2 )。然后将这些细胞产生的 HA 片段转移至初始 WT mFB（图5A）。在脂肪细胞分化培养基存在的情况下，LMW-HA 转移到 mFB 增加了Pref1的表达，并通过油红 O 增加的脂质染色测量增加了脂肪形成的形态学证据（图 5，B–D）。此外，由于 CD44、TLR2 和 TLR4 均被报道为 HA 受体 ( 38 – 40 )，我们从缺乏 CD44、TLR2 或 TLR4 的小鼠中分离出 mFB，并测试它们对 HA 片段的反应性。 TLR4 –/–细胞在暴露于 LMW-HA 后没有出现Pref1表达增加的反应（图5B）。在分化条件下以及添加 LMW-HA 后， CD44 –/–和 TLR4 –/–细胞中的油红 O 检测到的脂质积累受到抑制（图5C）。这些观察结果支持了以下假设：与 HA 的结合对于正常脂肪生成很重要，并且添加 HA 片段可以增强这种反应。

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为了直接测试皮肤中的 HA 消化是否会影响结肠，我们接下来使用表达 hHYAL1 (K14/HYAL1) 组织特异性诱导表达构建体的转基因小鼠。这些小鼠有效降解皮肤中的透明质酸 ( 34 , 35 )。 K14/HYAL1 小鼠仅在皮肤中显示 K14 mRNA 表达，并且没有结肠自发炎症的证据（补充图 3，A-C）。通过透明质酸结合蛋白 (HABP) 检测对结肠中的 HA 进行分析，结果显示 K14-HYAL1 小鼠结肠中的 HA 有所增加（补充图 3D）。与结肠中的情况相反，K14/HYAL1 小鼠的真皮和有皮肤伤口的 WT 小鼠的皮肤中 HABP 的 HA 染色减少（补充图 4））。 HA 染色的这种损失可能反映了 HA 的缺失或 LMW-HA 的消化，而 HABP 不容易检测到这一点（补充图 5）。

尽管 HABP 对 LMW-HA 的敏感性较低，但在皮肤受伤或金黄色葡萄球菌感染的小鼠以及 K14/HYAL1 小鼠的血清中观察到 HA 的相对水平增加。图6A）。与有皮肤伤口的小鼠类似，K14/HYAL1 小鼠的结肠中Cebpb表达也较高（图6B）。在 K14/HYAL1 小鼠的结肠中未检测到中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD4 阳性细胞或 CD8 阳性细胞的变化（补充图 6，A-E）。通过吸收评估，在口服 FITC-葡聚糖的 K14/HYAL1 小鼠或有皮肤伤口的小鼠的肠结肠中，上皮完整性没有变化；然而，在 DSS 攻击后，与对照小鼠相比，在有皮肤伤口的小鼠和 K14/HYAL1 小鼠中观察到肠道通透性显着增加（图6C）。值得注意的是，K14/HYAL1 小鼠在接受 DSS 攻击后，疾病严重程度显着增加，体重减轻和死亡率增加就证明了这一点。图 6、D 和 E）。与对照组相比，存活的 K14/HYAL1 小鼠表现出肠周脂肪扩张和上皮损伤增加（图 6，F–H）。 K14/HYAL1 小鼠的结肠中也表现出较高的Il6和Adipoq表达（图6、I和J）。

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K14/HYAL1 小鼠反应性脂肪生成增强的其他证据是暴露于 DSS 后Camp mRNA 和 Pref1 蛋白表达大幅增加（补充图 7）。这些发现与皮肤损伤后在结肠中观察到的结果相似。此外，K14/HYAL1 小鼠结肠粘膜下层的全组织 RNA-Seq 发现了广泛的转录反应，其中包括即使在没有 DSS 攻击的情况下Pdgrfa mRNA 的增加（补充图 8）。

最后，考虑到皮肤 HA 分解代谢改变的小鼠结肠的组成性变化，我们询问皮肤是否会影响粪便微生物组。粪便的 16S rRNA 扩增子测序显示，共养对照小鼠和 K14/HYAL1 小鼠的微生物组存在显着差异（补充图 9）。正如预期的那样，DSS 挑战还导致粪便微生物群落发生重大转变。在 DSS 存在的情况下，在对照小鼠和 K14/HYAL1 小鼠之间未检测到微生物组成的差异。这些结果表明，皮肤中HA的消化不仅改变宿主对结肠中DSS的免疫反应，而且还改变粪便微生物群落。肠道微生物组的这种变化可以作为上皮完整性丧失后触发脂肪生成的额外信号 ( 10 )。

讨论

这项研究的结果表明皮肤损伤如何影响结肠的功能。具体来说，皮肤炎症会刺激结肠粘膜下层中的成纤维细胞 IFC 亚群，并促进结肠炎期间脂肪细胞分化的增加。虽然多种机制可能有助于上皮器官之间的这种通讯系统，但我们的观察表明，皮肤炎症期间发生的 HA 消化在将损伤信号从皮肤传递到结肠方面发挥着重要作用。透明质酸酶在小鼠皮肤中的靶向表达集中于这种独特的免疫信号系统，因为 HYAL1 表达不会诱导皮肤炎症，而是概括了皮肤特异性干预对结肠炎症表型的巨大影响。由于HA的作用包括放大反应性脂肪生成，这在患有IBD的人类受试者中也观察到，因此真皮HA分解代谢的过程可以解释为什么炎症性皮肤病经常与IBD相关。

皮肤损伤或皮肤中的透明质酸消化后，未检测到结肠中免疫细胞丰度的变化。这并不能消除皮肤透明质酸酶表达可能导致淋巴亚群、循环细胞因子或可能影响结肠的激素信号发生未被检测到的变化的可能性。事实上，考虑到皮肤中透明质酸酶表达后粪便微生物组发生的变化，结肠宿主防御状态的整体变化似乎是可能的。这种结构性变化可能会导致 DSS 攻击后对结肠炎的易感性增强。观察到的局部组织微生物群落和其他免疫信号的贡献，是一个正在进行的研究主题，但并没有削弱皮肤透明质酸片段是影响结肠中观察到的表型的重要元素的证据。

此前已知 HA 在局部损伤或炎症后被消化并充当 DAMP ( 40 )，但该反应的后果尚不清楚。在肺和皮肤损伤模型中，TLR4 已被证明可以识别 HA 片段作为炎症介质 ( 41 – 43 )。相反，完整的 HMW-HA 对于细胞迁移和发育也很重要，包括在脂肪细胞发育过程中 ( 9 , 35 , 44 , 45）。因此，之前对 HA 分解代谢的研究主要集中在局部细胞事件而不是远端反应。我们的研究结果表明，在局部细胞外基质保持完整的情况下，从皮肤释放的额外 HA 片段可充当 DAMP，增强结肠粘膜下层前脂肪细胞对局部损伤做出反应的潜力。由于对 HA 片段和肠道细菌的反应都涉及 TLR4，因此这 2 个信号可能参与放大的反应。这可能会启动肠道上皮表面的宿主防御系统，为首先在皮肤中检测到的挑战做好准备。然而，与所有炎症反应一样，如果反应被夸大或不受控制，这可能会成为一把双刃剑。由于这些观察结果与 IBD 患者疾病的临床方面一致，通过 HA 阻断反应性脂肪生成或免疫串扰可能是一个治疗目标。总体而言，此处提供的数据显示了在评估肠道等其他上皮器官的功能时应如何考虑皮肤的功能。