1. Author

Mizgerd工作重点是肺部免疫学及其对急性下呼吸道感染的影响。研究阐明了肺部先天和适应性免疫细胞和信号的调节和功能，以及他们的变化如何导致肺炎。肺防御包括免疫抵抗（消除微生物的能力）和组织弹性（预防或抵抗感染和炎症的有害刺激的能力）。这两种活动都是通过肺内不同细胞类型的协调活动完成的，包括一些组成性存在的细胞（包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等）以及其他新招募到受感染组织的细胞（包括中性粒细胞和额外的髓样或淋巴细胞）。这些细胞之间相互作用可以有效地消灭微生物而不会损害肺部，从而保持呼吸健康。这些途径的失调反而会促进感染（例如肺炎）、损伤（例如急性呼吸窘迫综合征）和其他肺部疾病。阐明区分肺部感染抵抗力和易感性的因素将为预防和治疗肺炎提供新的方法。

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2. Background

2.1 驻留B细胞marker

驻留B细胞的标志性marker有：CD69、PD-L2、CD80、CD73。

CD69:是由CD69基因编码的人跨膜C型凝集素蛋白。它是一种早期激活标志物，在造血干细胞，T细胞和免疫系统中的许多其他细胞类型中表达。它也与T细胞分化以及淋巴细胞在淋巴器官中的保留有关。

PD-L2:程序性细胞死亡1配体2是一种在人类中由PDCD1LG2基因编码的蛋白质。PDCD1LG2也被指定为CD273。PDCD1LG2是一种免疫检查点受体配体，在适应性免疫应答的负调节中起作用。PD-L2是程序性细胞死亡蛋白1的两种已知配体之一。

CD80:免疫球蛋白超家族中的I型B7膜蛋白，具有细胞外免疫球蛋白恒定样结构域和受体结合所需的可变样结构域。它与另一种B7蛋白CD86紧密相关，并且经常协同作用。CD80和CD86都与共刺激受体CD28，CTLA-4和p75神经营养蛋白受体相互作用。

CD73: 5'-核苷酸酶，也称为ecto-5'-核苷酸酶或CD73，是一种在人类中由NT5E基因编码的酶。CD73通常用于将AMP转化为腺苷。

2.2 可诱导的支气管相关淋巴组织(iBALT)

肺呼吸不可避免地会使肺粘膜表面暴露于潜在的有害刺激物：包括病原体、过敏原和颗粒物——每一种都可能引发肺损伤和炎症。随着炎症消退，B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞通常会聚集在大支气管周围，形成可诱导的支气管相关淋巴组织 (iBALT)。IBALT 的形成可以由多种分子途径启动，这些途径汇集于表达趋化因子的基质细胞的活化和分化，这些基质细胞充当 iBALT 的支架并促进白细胞的募集、保留和组织。与传统的淋巴器官一样，iBALT 从血液中募集幼稚淋巴细胞，将它们暴露于局部抗原（在本例中是来自呼吸道），并支持它们活化和分化为效应细胞。iBALT 的活性明显有利于清除呼吸道病原体；然而，尚不清楚它是否会抑制或加剧对非感染性病原体的炎症反应。

2.3 肺炎链球菌

Streptococcus pneumoniae肺炎链球菌（肺炎球菌）是一种革兰阳性、alpha-溶血、需氧、有夹膜的双球菌。肺炎球菌感染是导致中耳炎、肺炎、败血症、脑膜炎和死亡的主要原因。通过革兰染色和培养确诊。治疗取决于耐药性，药物选择包括beta-内酰胺类、大环内酯类和呼吸系统氟喹诺酮类，截短侧耳素，或有时需要选用万古霉素。

目前根据肺炎球菌与型特异性抗血清的反应，已鉴定出 > 90种不同的肺炎球菌血清型。肺炎球菌多糖荚膜是逃避吞噬作用的关键。血清3型菌株比其他血清型包膜更厚，形成更多的黏液样菌落，是成年人侵袭性肺炎球菌病的常见原因。最严重的感染由血清型 3、4、6B、9V、14、18C、19F 和 23F 引起，这些血清型包括在最常最初接种的 PCV15 和 PCV20 中肺炎球菌结合疫苗。这些血清型引起约90%的儿童侵袭性感染，在成人中这一比例约60%。然而，这些血清型变异缓慢，部分原因为多价疫苗的广泛应用。19A血清型具有高度毒力和耐药性，已成为呼吸道感染和侵袭性疾病的重要原因；它现在被包括在15价和20价肺炎球菌结合疫苗中。更新的15价和20价肺炎球菌结合疫苗中还包括了其他引起感染的血清型。

2.4 高内皮微静脉(HEV)

HEV是一种表达外周淋巴结血管地址素(peripheral lymphonode vascular addressin, PNAd)的特殊血管, 幼稚淋巴细胞和中央记忆淋巴细胞由此 经循环作用进入淋巴器官。HEV可以作为识别 TLS的特征性标志, HEV的数目与肿瘤浸润淋巴 细胞数呈正相关, 含有HEV的肿瘤高表达CCL19、 CCL21、CCR6和L-选择素, 说明HEV是募集淋巴细胞的通道。

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3. Methods

小鼠实验

细菌感染

流式细胞术

细胞删除

Elisa

ELISpots

全血RNA-seq

荧光共聚焦显微镜

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4. Results

鉴于之前有研究报道：将SPF小鼠至于日常病原环境后，循环的血白细胞在转录组水平上有着显著的变化，实验团队推测肺炎链球菌的感染是否也会引起相同的变化。使用血清型为19F的肺炎链球菌每周两次免疫小鼠（感染方式为鼻喷）。发现免疫过的小鼠可以很好的抵御后续的SP3感染。对其全血的转录组进行测序，发现与未免疫的小鼠相比，只有4个基因的的mRNA的表达量有着变化——Lpp，Pmaip1，Nt5c，Arfgap2,但是变化都不显著，所以实验团队认为Sp19F感染并不会很大程度的改变循环细胞的转录组。

鉴于之前的结果，实验团队认为有一些未被探索的细胞类型起到了保护作用。同时删除CD4+TRM细胞后任然有良好的保护作用。值得一提的是实验团队观察到最初感染肺并没有扩散到对侧肺中，提示循环抗体的量是不足的。基于以上的结果，实验团队提出了科学假设：MBCs可能在感染的小鼠体内起着很好的保护作用。对两组小鼠进行免疫组化以及H&E染色，发现没有iBALT结构。为了定位B细胞，实验团队对其进行染色（B220和CD4），发现感染组中出现了B220阳性的细胞群。在传导气道附近，呈小细胞聚集体以及松散分散，且与CD4阳性的细胞关联度较高。此外与未感染组相比，感染组的支气管血管束内出现小的混合白细胞聚集体。这些细胞中的大多数是CD 19+或CD 4+，CD 19+细胞聚集在连接传导气道与肺动脉的疏松间质组织中，比动脉更靠近气道。因此感染的小鼠肺中B细胞定位于远端支气管血管束的结缔组织中。之后实验团队为了评估三级淋巴器官中高内皮微静脉（HEV）在感染组中是否具有特点对肺切片进行了CD34和外周淋巴结地址素（PNAd）染色。发现肺切片的血管内皮marker CD34明显，但是没有PNAd，说明肺切片中不存在HEV。

紧接着实验团队对这群特殊的B细胞进行了表型研究。他们首先通过静脉注射anti-CD45进行染色，以此来区分循环和驻留的B细胞。作者将CD19+CD45-的细胞群定义为EV B cell。感染组的EVB细胞主要是IgD-，但IVB细胞主要以IgD+为主。此外与Naïve组相比，IgD- EVBcell在感染后的显著增加。这提示我们在感染后富集了大量的非naïve-Bcell，可能是记忆细胞。在Sp19 F感染后12周内，肺中IgD-EV B细胞的数量保持恒定，6个月下降。 同时，实验团队发现感染小鼠的EV IgD- B细胞均有MBC表型——CD 38+。上述结果提示我们:反复的肺炎链球菌感染会在没有三级淋巴器官的情况下，诱导产生MBC。这些MBC 定位于支气管血管束，在近支气管的疏松结缔组织。

后续实验团队发现感染过Sp19F的小鼠会产生异型抗体。实验团队推测这些抗体中有一部分是来自于感染过后的LLPCS的。去感染组小鼠的骨髓细胞进行培养发现：在未刺激的情况下，上清中可以检测到肺炎链球菌特异性的IgG和IgA，说明了感染后骨髓中存在特异性的浆细胞。进一步实验团队想确定肺中是否存在这样一群细胞，便在ELISpot版上培养了未刺激的EV肺细胞。发现只有在感染组中存在这样一群B细胞。具有CD138+CD38lo表型的EV浆细胞在感染组小鼠中富集，同时这群细胞还表达Blimp-1 marker。而CD38+CD138-（同时表达B220和CD19）的这群细胞被认为是LLPCs的前体细胞。支气管肺泡灌洗液（BALF）的ELISA分析显示，从感染小鼠的未感染部位检测到异型抗肺炎球菌抗体。总之，这些研究表明：肺炎球菌感染引起LLPC在骨髓和肺中分泌异型抗肺炎球菌抗体，协助肺中MBC的积累。

接下来实验团队对这群未被CD45染色的，可能是驻留B细胞进行分析。发现这群细胞的表型为：CD69+与CD11a+。与IVB相比，EVB低表达归巢分子CD62L，高表达糖蛋白CD44。后续实验团队进一步聚焦在肺叶的B细胞表型上。首先Sp19F主要感染在左肺中，并且感染组的左肺中CD69+，CD11a+的EVB细胞明显高于右肺。之前所说由于感染导致的IgD-EVB细胞增加也仅限于左肺，所以肺炎链球菌感染引起的免疫学变化仅限于病灶部位——左肺。综上所述的所有研究证据表明：这些B细胞的表型提为BRM细胞。

在联体共生实验中，细胞仅限于原始而非伴侣小鼠意味着驻留。B细胞表型仅限于同侧叶而非对侧叶支持了这些细胞是肺驻留而非肺归巢的假设。然而，实验团队意识到另一种假设：这些B细胞不是常驻的，而是循环的B细胞，它们只归巢于先前感染的组织。紧接着实验团队EV肺MBC是否稳定地保留在肺隔室中。实验团队利用鼠CD20抗体删除外周循环的CD20+B细胞（IV和EV肺B细胞都表达CD20）。抗-CD20抗体给药后4天或2周有效地删除IV B细胞，但对EV B细胞没有影响。由于抗CD 20结合但不消耗EV肺B细胞，我们得出结论，这些细胞在整个2周的检查时间内不会重新进入循环。因此，由细菌性肺炎引起的肺MBC是肺驻留细胞而不是肺归巢细胞。

在证明小鼠在感染后体内存在BRM后，实验团队聚焦在了人。实验团队采用样品为肺癌病人样本。在人肺中观察到的CD 4 + T细胞显著多于B细胞。这些肺部的CD 19+细胞中大多数为CD 27+，其余细胞为IgD+。同时这些MBC与CD4+T细胞都是CD69+。这些肺部中的大多数MBC都发生了类别转换，只有大约17%表达IgM。CD69+MBC的CD38表型呈阴性，表明它们不是生殖中心或浆细胞。理论上，CD69除了作为驻留的marker以外活化的B细胞也表达，但几乎所有人样的CD69+MBC中CD83不表达，所以CD69很可能是常驻细胞的标志物。

既然在人和鼠中都观察到了这群BRM的存在，实验团队就想进一步的探究这群细胞的功能。尽管EVB细胞群内包括初始B细胞（IgD+IgM+），但IgM+IgD-的数量大于脾或来自肺的IV区室中的部分。此外，在EVB细胞群存在相当比例的类别转换的B细胞，其中大部分为IgG亚型，少部分为IgA。之前已有报道说PD-L2、CD 73和CD 80可以作为MBC的marker。在感染组的小鼠中如预期的那样，富集着大量这样表型的B细胞。并且EVB群大于IVB群。更重要的是如果共表达2种以上上述marker则可能是在激活后分化称抗体分泌细胞（ASC）。为了测试小鼠肺中是否存在这群ASC，实验团队了天然和感染组的总淋巴B细胞和EVB。体外培养4天后进行ELISpot，发现感染组的刺激B细胞检测到了更多的斑点。尽管刺激也引起脾细胞中的ASC分化，但在未处理小鼠和经历过的小鼠之间脾IgG ASC的数量没有显著差异。并且在感染组的肺来源体外培养上清中检测到了病原特异性的IgM和IgG，而脾脏来源的感染组与天然组都检测到了特异性的IgM和IgG。这些结果表明，天然小鼠的脾脏含有可被刺激以分泌抗肺炎球菌抗原的抗体的B细胞，并且在肺暴露于肺炎球菌后，这种B细胞没有显著富集。这些脾B细胞可能由先天性样边缘区或B 1 B细胞组成，仅在刺激下培养存活，并能够产生肺炎球菌结合抗体。为了炎症病原感染后肺中是否产生局部分泌的抗体，实验团队分析了感染组的小鼠的肺部灌洗液（0&96h），发现感染后恩等感染组小鼠BALF含有更多的病原特异性的IgG/IgA/IgM。这些结果表明：感染小鼠的肺的BRM细胞在异型病原感染后，局部分泌交叉抗体。

因为感染过后的小鼠可以产生抗体保护小鼠免受异型病原感染，同时实验团队观察到B细胞缺陷的小鼠比正常的小鼠细菌在载量更高，所以实验团队想探究是否B细胞相关的免疫机制起到了保护作用。尽管与正常的B6小鼠相比，实验团队构建的B细胞缺陷的小鼠模型产生的TRM也略有减少，但是在Sp3感染以后，感染的μMT仍能拥有与感染B6小鼠一样多的IL-17A(CD4+T细胞分泌)。既然实验团队的推测是BRM即抗体起到了保护作用，那么提出疑问：异型抗体是否足以在保护肺免受肺炎球菌感染。他们用Sp3预混了Sp19F康复小鼠以及naive的血浆去感染naïve的小鼠，发现用上述方法免疫得到的小鼠血浆比天然小鼠的血浆更具有保护效应，提示我们异型抗体可有助于肺防御肺炎球菌。之前有文献报道：脾脏含有B1细胞和边缘区B细胞，可以产生异型抗体，为了探究这些细胞是否有助于广谱的抗肺炎球菌肺防御，实验团队在Sp3感染前3周切除了脾脏。比较了切除组与对照组，发现所有感染的除了IgM组有区别外，其他没有显著区别。这个提示我们脾脏中的B细胞对于针对局部肺炎球菌感染的非型别依赖性肺免疫是无效的。紧接着实验团队试图探究血液和淋巴结迁移的循环B细胞是否是感染小鼠免疫所必须的。使用抗CD20抗体可以有效的删除循环B细胞，同时最大程度的保留BRM，他们测试了抗CD20治疗是否影响感染组小鼠的肺部免疫。在感染组B6小鼠中，抗CD20治疗删除循环B细胞4天后对Sp3没有影响，所以排除了循环B细胞的影响，进一步强调了BRM的作用。

综上所述，实验团队认为肺BRM对细菌清除具有很大作用，但是没有选择性删除BRM的方法。由于这群细胞（IgD- EVB）表达PD-L2+，所以实验团队想借助这个特点定向删除PD-L2+B细胞。他们构建了CD19-Cre杂交PD-L2-ZsGreen-Td-Tomato-diphtheria toxin的小鼠。在这个小鼠中，所有的PD-L2+的细胞都带有荧光 ，CD19-在Cre+与Cre-小鼠中带有绿色荧光蛋白，CD19+的细胞在Cre+小鼠中表达TdTomato以及DT受体。在感染Sp19F后可以在小鼠体内产生PD-L2+（TdTomato+）的EVB细胞，而对感染组的Cre+小鼠使用白喉毒素，可以有效的删除PD-L2+细胞群。相反在Cre-的小鼠使用白喉毒素，影响不显著。结合上面的实验模型，实验团队试图探究PD-L2+细胞群在感染小鼠中的作用。他们让Cre+和Cre-小鼠感染后自愈，之后将白喉毒素递送所有小鼠中试图删除Cre+小鼠中肺PD-L2+BRM细胞，之后用异型菌株感染小鼠。Cre+的小鼠的发病率显著提升。由于CD4+T细胞以及其分泌的细胞因子有助于肺部免疫，并且可以被B细胞提呈的抗原刺激，因此实验团队试图通过比较再次感染后的24或96小时后白喉毒素处理的Cre-与Cre+的T细胞因子水平，反应肺部免疫是否需要PD-L2+B细胞。发现IL17A与IFN-γ没有明显差异，说明T细胞应答不需要这群细胞。同时白喉毒素处理Cre+与Cre-小鼠在循环的异型抗体水平没有明显的差异，说明PD-L2+肺B细胞对循环抗体池没有实质性贡献。由于之前实验证实在感染期间IgG的水平是升高的，所以实验团队提出假设：局部肺抗体可能需要PD-L2+肺B细胞。为了测试PD-L2+肺B细胞的耗竭是否导致空气区抗体的减少，实验团队对BALF进行了抗体检测。与Cre-小鼠相比，Cre+小鼠中病原特异性IgG的水平显著较低。删除PD-L2+ B细胞的Cre+小鼠的空腔中IgG未被完全消除，但是小于Cre-中的一般，提示我们：识别Sp3的大多数但不是全部气隙IgG需要PD-L2+B细胞。除此之外，IgA与IgM的水平在Cre+小鼠中较低，一些残留的异型抗体可能是由肺浆细胞产生的。综上所述，BRM细胞有助于肺抗菌免疫，可能是通过重新激活后局部分泌异型抗肺炎球菌IgG。

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5. Discussion

作者：Kimberly A. Barker

通讯作者：Joseph P. Mizgerd

单位：Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts, USA.

年份：2021.06.01

期刊：The Journal of Clinical Investigation （JCI）

科学问题 ：肺中BRM是否需要iBALT并且iBLAT是否是肺BRM的特征

结论：本实验的研究表明肺炎链球菌感染恢复的小鼠体内存在肺部驻留B细胞（BRM），可以分泌广谱的保护抗体。结合流感也会引起肺的BRM，且实验团队证明了正常人肺组织富含BRM样细胞，所以他们认为BRM是肺适应性免疫的细胞库。COVID-19 大流行引发了广泛的关注和社会问题，有报道称从地方性冠状病毒感染康复者的人面对SARS-CoV-2时症状较轻，提示我们存在着针对SARS-CoV-2的交叉保护，这篇文章的结论——肺BRM发挥是发挥交叉保护的重要细胞群。除此以外BRM还有很多东西需要研究：BRM的招募与驻留因素；抗体组库；以及BRM细胞是否同TRM一样，广泛存在于器官中。