- 使用单核 RNA-seq 绘制人类白色和棕色脂肪形成的转录图谱 - PubMed

脂肪生成是维持机体能量平衡和健康代谢表型的关键，因此彻底理解其在人类中的分子调控至关重要。通过对 20,000 多个分化的白色和棕色前脂肪细胞进行单核 RNA 测序 (snRNA-seq)，我们构建了人类白色和棕色脂肪发生的高分辨率时间转录图谱。从单个个体的颈部区域分离出白色和棕色前脂肪细胞，从而消除了两个不同谱系的受试者间差异。这些前脂肪细胞也被永生化，以允许受控的体外分化，从而允许在脂肪形成进展过程中对不同的细胞状态进行采样。伪颞细胞排序揭示了早期脂肪形成过程中 ECM 重塑的动态，以及晚期白色/棕色脂肪生成过程中的脂肪生成/产热反应。与小鼠模型中的脂肪形成调节进行比较确定了几种新的转录因子作为人类脂肪形成/产热驱动因素的潜在靶标。在这些新的候选者中，我们探索了 TRPS1 在脂肪细胞分化中的作用，并表明其敲低会损害体外白色脂肪的生成。我们的分析中揭示的关键脂肪生成和脂肪生成标记物被应用于分析公开可用的 scRNA-seq 数据集；这些证实了最近发现的小鼠前脂肪细胞中独特的细胞成熟特征，并揭示了肥胖人类脂肪生成扩张的抑制作用。全面的，我们的研究对人类白色和棕色脂肪的生成进行了全面的分子描述，并为未来研究健康和代谢疾病状态下脂肪组织的发育和功能提供了重要资源。

成脂分化受到转录因子 (TF) 网络的调节，导致两种不同类型的前脂肪细胞发育成不同类型的脂肪：用于储存能量的白色脂肪细胞和用于产热能量消耗的棕色脂肪细胞。先前对脂肪生成调节的研究通常采用小鼠模型系统。例如，使用鼠 3T3-L1 细胞系的研究导致了核心脂肪形成转录级联的鉴定，包括PPARG和 C/EBP 等因子 [ 1 , 2 ]。进一步的研究重点是确定核心棕色脂肪与白色脂肪选择因子，从而确定产热表型的驱动因素和效应因素，例如 PRDM16、EBF、PGC1A 和 UCP1。3、4 []](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10338377/#bib91)。最近，现代转录组学研究已经确定了多种辅助转录因子，它们可以作为啮齿动物脂肪形成/生热反应的正向或负向调节因子[ 5 ]。总体而言，啮齿动物脂肪生成模型的研究为脂肪生成的分子调控提供了重要的见解。然而，由于两个物种之间脂肪组织的代谢、生理学和转录组调控存在差异，它们对人类的适用性受到限制。例如，BAT 在小鼠的肩胛间库中大量且均匀地存在，但在过去十年中才被发现存在于成年人中 [ 6]，并且其细胞组成是异质的，随给定区域的采样深度而变化[ 7 ]。此外，虽然 ADRB3 是一种肾上腺素能受体，据信可介导小鼠生热作用，但对其在人类生热作用中的作用存在相互矛盾的观察[ 8 , 9 ]。此外，最近的研究还强调了 BAT 代谢功能并未从啮齿动物转移到人类 [ 10 ]。因此，人们对了解人类脂肪细胞形成的转录控制产生了很大的兴趣[ 11 , 12]。对驱动脂肪生成的转录调控的全面了解将有助于深入了解人类的谱系决定、脂肪生成和产热因子，这些因子可能作为健康代谢表型治疗刺激的分子靶点。

最近，多项研究使用微阵列分析等批量基因表达谱技术，比较了人源脂肪干细胞 (ASC) 在成脂分化多个阶段的转录组谱[ 13,14,15,16,17,18 ] ， RNA-seq [ 19 ] 和 RT-qPCR [ 20 ]。这导致了新型脂肪形成转录因子的鉴定，例如 KLFs [ 21 ]、FOXs[ 22 ] 和 GATAs [23]]。然而，在分化过程中以密集的时间间隔对细胞进行批量采样，无法检测由异步分化引起的异质性以及感兴趣的细胞群内存在多个谱系的可能性。相比之下，单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 克服了其中许多挑战，并且可以以前所未有的分辨率提供复杂组织的无偏见转录组学视图 24,25,26 []。在原代脂肪组织中，最近利用单细胞水平测量研究了小鼠脂肪细胞发育的分子动力学 [ 27 , 28]。然而，原代组织的单细胞研究无法彻底采样脂肪生成的时间过程。在这项研究中，我们使用独特的、控制良好的体外模型系统绘制了人类白色和棕色脂肪生成的转录图谱 29 , [30]]，这使得能够在多个明确的发育阶段分离分化的前脂肪细胞。在该系统中，从单个个体的颈部分离出配对的白色和棕色原代前脂肪细胞（方法）。因此，该系统使我们能够测量白色和棕色谱系内部和之间的转录动态，同时控制通常与原始人类脂肪组织转录组分析相关的个体间变异，例如体重指数、基因型和性别。来自两个谱系的前脂肪细胞被分离出来，然后永生化以允许长期体外细胞培养。体外分化的脂肪细胞被证明可以恢复原代人颈部 BAT 和 WAT 的基因表达谱和功能 [ 29, 31 , 30 ] 并且永生化前脂肪细胞的转录谱与原代前脂肪细胞高度一致[ 32 ]。

2.1. snRNA-seq 可实现脂肪生成的高分辨率采样

对 5 个时间点中每个时间点的白色前脂肪细胞的独立分析显示，早在第 5 天就检测到了脂肪细胞（图 S1A），成熟脂肪细胞标记基因ADIPOQ的表达不断增加，祖细胞标记CD44的表达不断减少（图 S1A）。）随着时间的推移。使用 scVI 工具 [ 33 ] 整合这 5 个数据集揭示了细胞核沿着细胞状态连续体的结构（图1B），从早期前体细胞开始到成熟脂肪细胞（如ADIPOQ标记，图1C）。无监督聚类揭示了白色脂肪生成过程中的四个不同簇（图1D)，大多数第 0 天的核分组在 cluster-0 中，大多数第 20 天的核分组在 cluster-3 中，从而说明了从 cluster-0 到 cluster-3 的成熟度水平不断增加。在脂肪形成后期（第 10 天到第 20 天）收获的细胞核分布在所有簇中（图1E)，从而突出了体外模型系统中脂肪形成分化的异步行为。

第 0 天棕色前脂肪细胞的单核分析揭示了两种转录上不同的细胞群，一种富含与干细胞样状态相关的基因 (Preadipativity-1)，另一种富含与成纤维细胞样状态相关的基因。 Preadipcyto-2，[ 32 ]。所有 5 个时间点的综合分析表明这两个群体的脂肪形成能力存在差异（图 S1C），Preadipcyto-2 细胞分化为成熟脂肪细胞，而 Preadipcyte-1 群体经历最小的转录变化。在 20 天的时间过程中（图 S1C），在非脂肪形成群体（前脂肪细胞-1）中上调的基因的通路分析显示FOXO1的富集（图 S1D），一种已知的PPARG抑制因子[ 34 , 35 ]，表明 FOXO1 在抑制前脂肪细胞 1 群体的脂肪生成反应中可能发挥作用。我们通过将前脂肪细胞-1和前脂肪细胞-2群体的转录特征投影到原发性棕色脂肪组织中观察到类似的转录异质性（Vision [ 36 ]；到公开的人类棕色脂肪组织的 snRNA-seq 数据库上[ 37 ]；注 S2） ，图S6）。

在棕色脂肪形成簇中，不同天收获的细胞核分布在分化状态的连续体上（图1F), ADIPOQ的表达不断增加(图1G）。与白色**脂肪形成反应一样，无监督聚类在棕色脂肪形成反应期间识别出 4 个簇（图1H)，每个成熟度水平都在增加（图1我）。值得注意的是，第 20 天收获的细胞核主要分组在簇 2 中，而第 15 天收获的细胞核主要分组在簇 3 中（图1我）。我们将此观察结果归因于第 20 天的分化效率较低，从而导致与第 15 天相比，收获的成熟脂肪细胞（分组为第 3 组）的数量减少。我们进行了脂肪形成特征分析，其中根据每个细胞核的评分进行了评分脂肪形成基因的表达，显示第 20 天脂肪细胞在 cluster-3 中得分最高（图 S1E）。与白色脂肪细胞相比，分化的棕色脂肪细胞的棕色脂肪细胞特异性标记基因ZIC1 [ 38 ] 以及PGC1B 上调，PGC1B是肝葡萄糖和脂质代谢的调节剂 [ 39 ] 和公认的产热标记 [ 40 ] ;图S1F）。分析成熟白色和棕色脂肪细胞（cluster-3）之间的差异表达，然后进行转录因子富集分析图1D vs cluster-3 in 中图1H) 发现棕色脂肪细胞中富集的顶级转录因子是FOXS1 [ 41 ] 和FOXC2 [ 42 ]。因此，我们的实验策略使我们能够捕获一系列正在分化为白色或棕色脂肪细胞谱系的细胞状态。

2.2.分化前脂肪细胞的伪时间排序识别细胞外基质 (ECM) 重塑、脂肪生成和产热的动态

2.2.2.细胞粘附破坏之后是早期脂肪形成过程中的纤维至基底膜型 ECM 重塑。(这个很重要！脂肪生成伴随着ECM重塑失调，也就是纤维化！！！)

脂肪形成过程中的 ECM 重塑是纺锤形前脂肪细胞转变为球形、脆弱、富含脂质的脂肪细胞时提供适当生态位的关键 45 , [46 ] ]。 ECM 重塑失调是临床肥胖的一个标志，其中脂肪组织由于纤维状 ECM 成分（例如 1、-3 和 -5 型胶原蛋白）沉积增加而变得纤维化 [ 47]。虽然 ECM 重塑对于健康的脂肪生成扩张至关重要，但 ECM 重组的精确动态及其分子调控仍然知之甚少。在这里，我们重点关注模块 1、2 和 3 之间的差异动力学（图 S2I 和 S2J），为人类脂肪形成过程中 ECM 重组的时间调节提供新的见解。

在白色脂肪形成过程中，添加脂肪形成培养基（模块 1）后经历快速下调的基因主要包括细胞粘附分子 (CAM)，如ITGB8、ITGA11和ITBBL1，以及生长因子，如VEGFA、VEGFC、FGF2和FGF5（图2F，表 S2 和 S4）。这些观察结果得到了先前研究的支持，这些研究报告了脂肪形成过程中此类整合素相关基因的下调[ 48,49,50 ]，以及这些生长因子已知的抗脂肪形成作用[ 51,52,53 ]。值得注意的是，CAM 作为细胞和 ECM 之间的接触点；因此，CAM 的下调表明细胞-ECM 接触的破坏是对诱导介质的非常早期的反应。模块 2 基因经历更渐进的下调，主要包括 ECM 结构成分（图2F，表S2和S4 )，例如纤维状胶原蛋白类型COL1、COL3和COL5。这一观察结果与之前对脂肪生成过程中基因和蛋白质水平 ECM 重塑的观察结果一致 [ 45 , 54 ] ，这表明纤维状 ECM 成分的降解为基底膜型 ECM 成分（例如胶原蛋白 4）铺平了道路。更适合支持球形脂肪细胞[ 55 , 56 ]。事实上，在我们的数据集中， COL4的表达在白色脂肪形成过程中逐渐增加（图 S2C，表 S2））。模块 2 还包括下调的细胞骨架成分，例如肌动蛋白 ( ACTB )、微管蛋白 ( TUBB ) 和波形蛋白 ( VIM )（图2F，表S2和S4），与之前的报告一致[ 57 , 58 ]。模块 3 基因（瞬时上调）主要由蛋白酶抑制剂组成，例如 TIMP3 和 SERPINF1（图2F，表 S2 和 S4）。蛋白酶抑制剂 TIMP3 的上调也通过蛋白质印迹分析得到验证（图 S9）。蛋白酶抑制剂作为 ECM 构建酶，拮抗 MMP、ADAM 和 ADAMTS 等金属蛋白酶的 ECM 降解活性 [ 59 ]。值得注意的是，在我们的数据集中，所有此类金属蛋白酶在白色脂肪形成过程中均被下调（图S2D））。因此，我们的结果与细胞粘附接触的最初破坏、随后金属蛋白酶活性促进 ECM 降解以及随后通过蛋白酶抑制剂活性转向 ECM 再生的转变是一致的。这一发现也与之前报道的通过金属蛋白酶及其抑制剂的活性对脂肪细胞分化进行功能调节的研究一致[ 60,61,62,63,59 ]。

2.2.3.脂肪生成、脂肪生成和产热的差异转录动力学

通常，脂肪合成（或脂肪生成）伴随脂肪生成的后期阶段，因为前脂肪细胞积累成熟脂肪细胞特有的脂滴。然而，之前的研究已经确定了脂肪细胞成熟过程中脂滴生物发生、扩张和收缩特有的不同途径和调节因子[ 64 , 65 ]，表明存在脂肪生成特异性的转录网络。同样，调节生热作用的棕色脂肪特异性转录网络也已被发现 [ 66 , 4]。单细胞的伪时间排序为更好地理解白色和棕色脂肪组织分化过程中这些过程的相对转录动力学提供了机会。

在白色脂肪生成中，模块 4 主要由调节脂质动员的基因组成，例如PLIN1、FABP4、CD36（图 S8A）和脂肪生成转录调节因子，例如PPARG、MLXIPL和ZBED3 [ 67 , 68 ]（图 S8B），所有其中相对于伪时间轴逐渐上调（图2F，表 S2）。另一方面，模块 5 包括脂肪生成基因，例如FASN、ACSL1、GPAM和脂肪生成转录因子NR1H3 [ 69 ]；图2F，图S8C，表S2 )。这一观察结果与途径分析一致，途径分析揭示了模块 4（表 S4 ）中脂肪生成调节项和模块 5（表 S4 ）中脂肪酸生物合成项的富集。平均而言，模块4中的基因在比模块5中的基因更早的假时间点显着上调（logFC>1）（图S3A），这表明与脂肪形成反应相比，脂肪形成转录反应的开始延迟。

在棕色脂肪生成中，模块 4 由脂肪生成反应的转录调节因子组成，例如PPARG、FABP4、SREBF1 [ 70 , 71 ]（图2H，图S8D），通过通路分析确定脂肪酸生物合成的富集和脂质代谢相关术语（表S5）。另一方面，模块 5 丰富了生热术语，例如 AMPK 相关脂肪分解途径 [ 72 , 73 ] 和线粒体生物发生途径（表 S5）。因此，我们的结果表明，棕色脂肪发育过程中脂肪生成反应早期开始，随后是产热反应。

2.4. TRPS1敲低损害白色脂肪生成

TRPS1 已被证明是 GATA 调节基因的抑制因子，并且已知 GATA TF 在脂肪细胞形成中发挥重要作用 [ 88 ]。TRPS1在我们的富集分析中也被鉴定为分化早期表达的 TF 之一（图3一个）。因此，我们试图通过永生化白色前脂肪细胞（分化第-2.5天）中TRPS1的siRNA介导的敲低（KD）来探索TRPS1对体外白色脂肪生成的作用。 siRNA敲低后，我们诱导这些前脂肪细胞的分化（第0天），并沿着脂肪细胞分化的几个时间点评估脂肪生成的标记物（图S10A）。首先，我们证实针对 TRPS1 的 siRNA 在分化第 0 天导致脂肪形成祖细胞中TRPS1表达的有效敲低（>90% 减少），这种效果在诱导分化后第 2 天和第 5 天得以维持（图4一个）。接下来，我们评估了脂肪形成祖细胞中分化早期（第0-5天）的TRPS1 KD是否会影响其脂肪形成能力。油红-O 染色显示分化第 18 天成熟脂肪细胞数量显着减少（图4B)，伴随着ADIPOQ、LEP和CIDEA表达显着减少的效果（图4C)，表明分化早期阶段TRPS1表达的缺乏会损害脂肪生成。为了深入了解TRPS1 KD 损害脂肪生成的机制，我们测量了调节早期脂肪细胞分化的已建立关键 TF 的基因表达。我们观察到TRPS1 KD 导致分化第 2 天和第 5 天TF CEBPA、PPARG和ZFP423的表达显着减少（图4D）。值得注意的是，响应TRPS1 KD， NR4A1的表达在分化第 0 天增加（图4D）。先前的研究表明，NR4A1 的过度表达会损害体外脂肪形成[ 89 ]。还观察到分化第2天和第5天对CEBPB和CEBPD表达的小影响(图S10B )，然而GATA2和GATA3的表达没有响应TRPS1 KD而改变(图S10C )。总的来说，这些发现表明，对体外WAT 和 BAT 分化的转录景观进行高分辨率测量能够识别脂肪生成的重要调节驱动因素。