项目文章 | PHDGH激活PKM2诱导组蛋白H3T11磷酸化进而减弱细胞衰老的调控机制

2023年05月10日，湖北大学生命科学学院李珊珊课题组在综合性期刊1区Top期刊Nature communications (IF=17.694)上发表了题为“Phosphoglycerate dehydrogenase activates PKM2 to phosphorylate histone H3T11 and attenuate cellular senescence”文章阐明了PHGDH与PKM2相互作用，促进PKM2的激活，从而引发组蛋白H3T11位点磷酸化,进而而减缓细胞衰老过程。这一发现具有重要的生物学意义，为深入理解细胞衰老的分子机制提供了新的线索，并为未来研究和治疗衰老相关疾病提供了潜在的目标。元莘生物参与了部分转录组测序的工作。

 研究背景 Origingene 

衰老是大多数人类疾病的主要影响因素，衰老的主要诱因是细胞衰老，清除天然存在的衰老细胞，可以改善与年龄相关的病理，并延长小鼠模型的寿命。衰老EC（血管内皮细胞）与血管老化和老龄化血管疾病显著相关，特别是动脉粥硬化和高血压；因此阐明细胞的衰老机制可以为减缓衰老过程以及改善老龄化人口生活质量提供潜在的干预目标。

能量代谢的改变是衰老的重要标志，代谢酶和葡萄糖代谢都与衰老密切相关，并且细胞代谢可以通过表观修饰调控（组蛋白修饰和DNA甲基化）来调控细胞衰老；葡萄糖代谢中磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）的缺失会导致丝氨酸合成物减少，进而导致EC生长缺陷，但是糖酵解酶和中间代谢途径对于EC衰老的影响还不明晰。

本研究比较了衰老和年轻EC的转录组，进一步发现了糖酵解衍生的从头丝氨酸合成途径显着下调，并且PHGDH在缓解ECs衰老的同时具有丝氨酸依赖性和丝氨酸依赖性功能，进一步研究发现：PHGDH促进PKM2的稳定性和组蛋白H3T11的磷酸化，构成PHGDH-PKM2-H3pT11轴，调节衰老相关基因的表达，防止过早衰老；本研究揭示了PHGDH / PKM2 调节细胞衰老的机制，并且提出了增强丝氨酸生物合成作为一种潜在的抗衰老疗法。

研究思路 Origingene 

 研究结果 Origingene 

1.PHGDH介导的丝氨酸合成可以防止细胞衰老

研究首先通过转录组测序鉴定细胞衰老过程中差异表达的基因，年轻细胞（P6）和衰老细胞（P20）进行RNA-seq，衰老过程中共由4037个差异基因表达，上述差异基因富集到细胞周期、细胞衰老、p53信号通路以及甘氨酸苏氨酸丝氨酸代谢上，其中PHGDH、PSAT1和PSPH催化糖酵解衍生的从头丝氨酸合成，经过定量鉴定，证实PHGDH在衰老细胞中显著降低，且siRNA敲除PHGDH后，细胞中的丝氨酸水平显著降低。

PHGDH是由ATF4（ATF/CREB 转录因子家族的成员）诱导，转录组测序结果显示衰老过程中，ATF4的转录本和蛋白水平均显著降低，且敲除ATF4后PHGDH转录本水平降低和丝氨酸减少。综上，说明PHGDH介导的丝氨酸生物合成途径在细胞衰老过程中显著下调。

细胞培养实验中，外源丝氨酸可以降低衰老细胞的占比，同时减弱了P20的EC细胞的衰老表型；且对PHGDH敲除的细胞系进行染色和原位观察发现细胞衰老加剧，过表达之后细胞衰老减缓，敲除ATF4后叶加速了细胞衰老；加入外源丝氨酸会减缓敲除PHGDH和敲除ATF4带来的细胞衰老，即丝氨酸可以缓解细胞衰老。并且研究了丝氨酸下游产物对细胞衰老的影响，发现添加下游产物并不能延缓细胞衰老，因此是丝氨酸而不是其下游产物减缓细胞衰老。综上，功能丧失和过表达实验结果表明：PHGDH介导的丝氨酸生物合成可缓解细胞过早衰老。

2.丝氨酸通过靶向PKM2减缓细胞衰老

研究采用了药物亲和响应靶标稳定性（DARTS）技术预测丝氨酸的靶标，丝氨酸和Hela细胞裂解物孵育，通过LC-MS以及免疫印迹等实验流程发现丝氨酸可以直接结合PKM2（丙酮酸激酶M2），PKM2的功能是维持内皮细胞增生和血管完整性。且敲除PKM2后会加剧细胞衰老（p21表达升高，HMGB1表达降低，SA-β-gal阳性细胞百分比增加和SAHF形成）；相反，PKM2的过表达会显著减弱细胞衰老。

PKM2的H464A位置的组氨酸残基会跟丝氨酸结合，而PKM2 H464A突变体的异位表达在含丝氨酸培养基中生长时不能改善细胞衰老也证实了这个结论；同时实验发现外源丝氨酸并不能减缓敲除PKM2的细胞的衰老；因此，综上数据表明丝氨酸通过靶向PKM2来延缓细胞衰老。

3.PHGDH与PKM2相互作用及抑制PCAF催化的PKM2 K305乙酰化，以保护PKM2免受自噬介导的降解

外源丝氨酸并不能完全缓解PHGDH敲除造成的细胞加速衰老，即PHGDH还存在丝氨酸非依赖性功能，通过蛋白互作实验发现PKM2是PHGDH的一种互作蛋白。免疫荧光染色显示：PHGDH和PKM2在细胞内共定位，主要存在于细胞核内。

在实验过程中发现敲低PHGDH会导致PKM2的蛋白水平降低，但PKM2的mRNA水平变化不大，同时通过环己酰亚胺（CHX）阻断蛋白质合成，然后检查PKM2蛋白水平，发现PKM2在shPHGDH细胞中的半衰期显著降低，表明需要PHGDH来维持PKM2的稳定性；后续通过分别用泛素-蛋白酶抑制剂和自噬-溶酶体途径抑制剂处理，发现敲低溶酶体后会使得shPHGDH细胞中的PKM2蛋白含量升高。综上表明，PHGDH缺乏后会诱导溶酶体降解PKM2。

PKM2可以被乙酰转移酶PCAF乙酰化，进而导致PKM2被自噬降解。PKM2与PHGDH结合的区域为PKM2-K305区域；乙酰化蛋白组检测结果显示，敲低PHGDH后，PKM2-K305的乙酰化水平显著升高；进一步通过体外共IP实验表明，纯化的重组PHGDH直接减少了PCAF和PKM2之间的相互作用；同时PCAF的敲低会使得PKM2蛋白水平升高，去乙酰化酶SIRT2的过表达也会使得PKM2蛋白水平升高；PKM2 K305R突变增加了PKM2，并显着减弱了细胞衰老；综上，PHGDH通过抑制PCAF催化的PKM2 K305ac和稳定PKM2来防止过早衰老。

4.PHGDH增强p300催化的PKM2 K433乙酰化并促进其核转运

PKM2通常以四聚体的形式存在于细胞质中，并作为代谢物激酶。然而，在表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）激活后，PKM2可以以二聚体的形式易位到细胞核中，并作为癌细胞中的转录共激活剂或蛋白激酶。

荧光定位结果显示，PKM2在shPHGDH细胞中的表达降低，与免疫印迹数据一致，且核PKM2蛋白水平显著降低；分离细胞质和细胞核的免疫印迹结果显示，shPHGDH HUVECs中核PKM2信号显着降低，但PSAT1和PSPH的细胞核定位不受PHGDH敲低的影响。

乙酰转移酶P300乙酰化PKM2-K433,进而导致PKM2二聚化，证实了PHGDH会诱导PKM2的核易位。特异性抗体免疫结果显示：PHGDH的沉默显著降低了PKM2 K433ac，与 shPHGDH 细胞中 PKM2 的核定位减少一致；PHGDH的过表达增加了PKM2和p300之间的相互作用，而PHGDH的敲低降低了PKM2-p300之间的相互作用，结合体外co-IP结果（PHGDH直接增加了PKM2与p300共IP的量），且分子对接中PHGDH可以与PKM2和p300形成稳定的形式，证实了PHGDH促进p300介导的PKM2 K433乙酰化。敲低p300减少了PHGDH和PKM2之间的相互作用，表明PHGDH会更偏向于跟二聚体PKM2相互作用。这些数据表明PHGDH促进PKM2的核易位，从而防止细胞过早衰老。

5.PHGDH通过刺激PKM2诱导组蛋白磷酸化（H3pT11）

研究重点关注PHGDH和PKM2在细胞衰老中的核功能；在肿瘤细胞中，PKM2会易位到细胞核中，并作为蛋白激酶磷酸化组蛋白H3pT11；PKM2的敲除显著降低了细胞中的H3pT11水平；PKM2-K367M；过表达 WT PKM2而不是其激酶死亡突变体 PKM2 K367M 增加 HUVEC 中的 H3pT11。WT PKM2而不是 PKM2 K367M 的过表达拯救了 PKM2敲低 HeLa 细胞中减少的 H3pT11。综上，核PKM2磷酸化内皮细胞中的H3T11。PHGDH增强PKM2稳定性并促进PKM2核易位。

PHGDH、ATF4的敲低均显著降低了H3pT11水平；研究使用纯化的PHGDH、PKM2和H3T11进行体外激酶测定，单独纯化的重组PKM2在H3T11上几乎没有活性，但当与纯化的重组His-PHGDH预孵育时，其活性显着增强，表明PHGDH直接刺激PKM2的活性磷酸化H3T11。

丝氨酸是PKM2的激活剂，体外丝氨酸可以提高siPHGDH细胞中降低的H3pT11水平，但无法改变siPKM2中的水平，但体外添加丝氨酸可以显著增加PKM2磷酸化H3T11的活性；因此综上，PHGDH通过促进PKM2催化的H3pT11，部分改善细胞衰老。

6.PHGDH-PKM2-H3pT11轴调节SIRT1和衰老相关基因的转录

PHGDH和PKM2敲低细胞的RNA-seq分析数据具有一定的相关性（0.42），GSEA分析显示，PKM2和PHGDH显著调控与细胞衰老相关的基因，这些衰老基因中，PHGDH和PKM2共同调节21个衰老相关基因的表达。荧光定量结果显示：PHGDH和PKM2的敲低显著降低了衰老相关基因的转录，包括SIRT1，HIST1H3H，BMI1和LAMA1。其中SIRT1已被报导在调节衰老中发挥了重要作用；敲低PKM2也会显著降低SIRT1的表达，表明SIRT1的表达在内皮细胞的转录水平上受PHGDH和PKM2的调控。

丝氨酸治疗部分挽救了PHGDH敲低细胞中SIRT1，BMI1和LAMA1的转录减少，但不能挽救PKM2敲低细胞；ChIP分析表明，PHGDH或PKM2的敲低显着降低了SIRT3，BMI11和LAMA1处H1pT1的富集，表明PHGDH-PKM2-H3pT11轴调控EC中衰老相关基因的转录。

通过比较siPHGDH、siPKM2和siSIRT1的RNA-seq数据，我们发现siSIRT1的转录组与siPHGDH和siPKM2的转录组呈正相关，相关效率分别为0.58和0.38；在PHGDH-敲低和PKM1-敲低细胞中过表达SIRT2，发现SIRT1（SIRT1 OE）的过表达降低了siPHGDH和siPKM2 HUVECs中的加速细胞衰老；综上数据表明：PHGDH刺激PKM2磷酸化H3T11并调节衰老相关基因的转录的能力，从而防止细胞过早衰老。

7.PHGDH和PKM2改善小鼠衰老特征

研究分析了自然衰老后小鼠PHGDH-PKM2-H3pT11轴上蛋白质的表达，老年小鼠中ATF4、PHGDH和PKM2的蛋白水平显著降低，同时老年小鼠心脏中H3pT11和SIRT1的水平也显着降低；PKM2 K305ac在老年小鼠心脏中显着增加，而PKM2 K433ac在老年小鼠心脏中显着降低，与老化过程中的PKM2蛋白变化趋势一致，而PKM2转录在衰老过程中没有显著变化但ATF4，PHGDH和SIRT1的转录减少。综上表明：PHGDH-PKM2-H3pT11轴在自然衰老小鼠中下调。

重组腺病毒相关病毒（rAAV1），使得PKM2和PHGDH在小鼠内皮上特异性表达， 均通过尾静脉注射到老年（18个月大）小鼠中，4周后，通过免疫印迹检测到主动脉内皮中PHGDH和PKM2的特异性表达，且免疫印迹和组织学染色检测到H3pT11和SIRT1也显著增加，综上表明：PHGDH-PKM2-H3pT11轴在AAV-PHGDH和AAV-PKM2治疗小鼠的主动脉中增强。PHGDH和PKM2的VE靶向表达可以显著降低心脏重量，并增加了内皮依赖性松弛。数据表明，PHGDH和PKM2的VE靶向表达可防止体内与年龄相关的心脏和肌肉功能下降。

 结果讨论 Origingene

血管内皮细胞（EC）的糖酵解及中间调控路径尚不明晰；研究将PHGDH介导的丝氨酸生物合成的下调左右EC衰老的标志，通过实验发现了PHGDH延迟细胞衰老的两种途径：一方面，PHGDH激活丝氨酸合成，然后作为共激活剂刺激糖酵解酶PKM2的活性；另一方面，PHGDH促进PKM2的稳定性和核定位，PKM2随后磷酸化H3T11，并调控下游衰老相关基因的表达。研究揭示了糖酵解和糖酵解衍生物的丝氨酸代谢在内皮细胞衰老中的功能。

PHGDH与PKM2相互作用，防止PCAF催化的PKM2 K305和随后的自噬降解。PHGDH还增强p300催化的PKM2 K433乙酰化并促进PKM2核易位。PHGDH与PSAT1和PSPH一起提供局部丝氨酸以刺激PKM2的活性以磷酸化H3T11并调节衰老相关基因的表达。

研究发现了PHGDH-PKM2-H3pT11轴，PHGDH通过该轴调节衰老相关基因的表达并防止过早衰老。因此，本研究揭示了丝氨酸代谢和糖酵解在细胞衰老中的功能，并为改善衰老表型提供了潜在的靶点。

参考文献

Zhu, Chuanxi et al. “Propionate poses antivirulence activity against Botrytis cinerea via regulating its metabolism, infection cushion development and overall pathogenic factors.” Food chemistry vol. 410 (2023): 135443. doi:10.1016/j.foodchem.2023.135443