合适的内参选择，精准的荧光PCR定量

一、实时荧光定量PCR定义

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR，qPCR)是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

二、荧光定量PCR工作原理

1.荧光探针法

在PCR过程中加入一对引物得同时加入一个特异性荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团。当报告荧光基团和猝灭荧光基团链接在一条链上时，报告荧光基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收，因此检测不到荧光信号。当PCR扩增时，Taq酶将探针酶切分解，报告荧光基团与猝灭基团分离，产生可以被检测得荧光信号，且荧光信号的强度与扩增的DNA链数量成正比。

2.荧光染料法

目前最常用的荧光染料是SYBR Green I，是一种具有绿色激发波长的燃料。游离状态下SYBR Green I的荧光非常微弱，在与双链DNA结合后，荧光大大增强。荧光信号强度与双链形成数量成正比，因此可以用于PCR合成双链数量的定量检测。

三、内参基因选择

内参基因，也成为“管家基因”、“持家基因”，因其在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因表达水平变化时被用作参照物，所以被叫做内参基因。

内参基因可以用于矫正由于上样量、上样过程中存在的误差。理想的内参基因的选择可以有效提高荧光定量PCR的灵敏度和重复性。理想的内参基因应在研究的各种试验因素条件下均恒定表达。然而大量研究表明，任何一种内参基因都不能在所有试验条件下恒定表达，因此在进行定量分析前，应进行内参基因的验证，选定一种较为稳定的理想内参基因。

常见的内参基因包括GAPDH、β-actin、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。