合作文章|单细胞转录组在褐鳟鱼研究方面取得新进展
主题:单细胞转录揭示褐鳟感染沙门氏菌气单胞菌的细胞免疫分析
发表期刊:Aquaculture
影响因子:3.9/Q1
组学方法:C4单细胞转录组
研究背景
褐鳟鱼(鲑鱼)是一种鲑鱼亚种,是世界范围内很受欢迎的鱼类,具有巨大的经济和食用价值。然而,褐鳟鱼对鲑鱼气单胞菌没有抗药性,由于这种细菌在淡水和盐水环境中的广泛存在,导致了渔业的大量损失。本研究阐明了褐鳟鱼如何对沙门氏菌产生相应的抗性,并鉴定了相关的抗性基因。这些结果可以通过比较不同治疗组间的细胞和基因表达差异,提高对沙门氏菌耐药性相关的细胞和分子生物学机制的理解。此外,该研究为抗病褐鳟品种的育种提供了宝贵的遗传资源。
研究结果
1 褐鳟感染沙门氏菌的表型分析
褐鳟腹腔注射沙门氏菌后易感组表现出多种病症:腹腔多处出血、充血、腮丝受损等(图1A、B)。此外,通过组织病理学分析发现,细菌感染引起的循环障碍在易感组中表现为鳃次生层广泛充血、后肠肠细胞空泡化和头肾肾小管扩张,而对照组和耐药组明显不存在这些现象(图1C-E)。
2 沙门氏菌在褐鳟中引起炎症反应
为了确定沙门氏菌是否会诱发褐鳟的免疫反应,对血清中的IgA、IL-1β和TGF-β1水平进行了评估。结果显示,易感组和抗性组的 IgA 和 IL-1β 明显高于对照组,易感组的 IgA 和 IL-1β 水平高于抗性组(图 2A 和 B)。易感组的 TGF-β1 含量明显低于对照组,而对照组和抗性组之间无明显差异(图 2C)。这些结果表明,接种沙门氏菌后,易感组和抗性组都出现了不同程度的炎症反应,这可能进一步引起了免疫反应。使用 B 细胞标记物 CD19 和 T 细胞标记物 CD3 进行免疫荧光检测发现,CD19 的荧光强度在易感组>抗性组>对照组中更高,CD3 的荧光强度在易感组<抗性组<对照组中更高(图 2D-F)。
3 褐鳟头肾组织的总体特征
对耐药组、易感组和对照组的头肾组织进行scRNA-Seq,鉴定到不同的细胞类型以及marker基因。通过细胞聚类分析,初步鉴定出22个簇(0−21)。基于已知的Maker基因,cd79a、cd79b和ksr1b在B细胞中特异性表达,因此将簇14定义为B细胞簇。il2rb、TOX2和txk等基因在T细胞中表现出特异性表达,因此集群8、15和21被定义为T细胞。blvrb、cahz、hbaa1、tspo基因主要在红细胞中高水平表达,将簇3、6、12、13定义为红细胞。hdr、mpl和itga2b基因在造血干细胞/祖细胞(HSPCs)中特异性表达,将集群16和18被定义为HSPCs。cldn19、col1a2、THBS1基因主要在内皮/上皮细胞中高水平表达,因此,第19簇被定义为内皮/上皮细胞簇。mpx、ncf1、alox5a、ita4h、cfl1l和alox5ap基因在粒细胞/中性粒细胞和树突状细胞(DC)中均有高表达,这导致TLR5和batf3基因高表达的簇1和7被定义为DC,而其余的簇0、2、5、9、10、11和17被定义为粒细胞/中性粒细胞。因此将22个细胞簇分为8种不同的细胞类型。
4 感染沙门氏菌后褐鳟头肾组织细胞数量的变化
对照组和耐药组的粒细胞/中性粒细胞和树突状细胞(DCs)的数量均显著高于易感组。与易感组相比,对照组和耐药组的红细胞和巨噬细胞簇的数量都较低。对于T细胞簇,结果发现易感组和耐药组的细胞数量都高于对照组,耐药组的T细胞数量甚至更多。
5 粒细胞/中性粒细胞和树突状细胞可能参与褐鳟的先天抗性
对粒细胞/中性粒细胞细胞中表达水平显著高于易感组的基因进行GO富集分析,发现这些基因主要与肌动蛋白丝结合和Arp2/3蛋白复合物的调控有关。KEGG富集结果发现显著富集的途径包括肌动蛋白骨架的调节,Fcγr介导的吞噬、白细胞跨内皮迁移和FcεRI信号通路。粒细胞/中性粒细胞和 DCs 表现出相似的功能富集结果和基因表达的显著差异,尤其是在肌动蛋白丝聚合方面,这表明它们具有基本的细胞功能。由于对照组没有受到细菌感染,因此这些细胞和基因与耐药组的细胞和基因表现出相似性。CXCR4 和 ccr9a 等基因与免疫功能密切相关。因此,研究者推测粒细胞/中性粒细胞和 DCs 与褐鳟的先天抵抗力有关。
6 在沙门氏菌感染的褐鳟中诱导红细胞和巨噬细胞的基因表达
易感组中,红细胞和巨噬细胞数量显著增加。KEGG富集分析发现红细胞上调基因参与蛋白质水解等过程。同样,巨噬细胞中显著上调的基因表现出与红细胞相同的富集结果。红细胞和巨噬细胞的富集结果和上调基因表现出许多相似之处。感染沙门氏菌后,缺乏抵抗力的易感组会出现炎症反应,表现为出血等生理症状。
7 T 细胞基因表达增强了褐鳟鱼对沙门氏菌的抵抗力
T细胞数量在耐药组中最多,对耐药组上调基因的 GO 富集分析显示,包括蛋白酪氨酸磷酸酶活性、蛋白去磷酸化、磷酸酶活性和去磷酸化在内的通路显著富集。KEGG 分析显示,胰岛素信号通路中富集了更多的基因,在耐药组 T 细胞中明显上调的基因中,鼻指骨综合征1基因、CUB和csmd3a、cdh13、cdh23、谷氨酸受体4、CSMD1、蛋白酪氨酸磷酸酶受体T型、跨膜蛋白132c、Eph受体B1 (EPHB1)、神经表皮生长因子样1和其他几个基因与T细胞活化密切相关。
8 细胞分化与褐鳟抗性的关系
为了研究褐鳟不同细胞类型的分化和发育,本研究进行了拟时序分析。结果显示,这些细胞可分为五种不同的状态,并以特定的基因表达模式为特征。在这些状态中,有两个关键的节点,节点1产生状态1和状态5的细胞,节点2产生状态3和状态4的细胞。研究每种状态下的细胞组成发现状态3和状态4的细胞主要由树突状细胞、粒细胞/中性粒细胞和少量巨噬细胞组成。另一方面,状态1和状态5的细胞主要由红细胞、造血干细胞、T细胞、B细胞和内皮/上皮细胞组成。易感组树突状细胞和粒细胞/中性粒细胞数量的减少表明与节点2密切相关。
研究结论
本研究发现褐鳟感染沙门氏菌后,树突状细胞和粒细胞/中性粒细胞可能受到肌动蛋白的调控,参与对沙门氏菌的识别和吞噬,因此导致易感组中这种细胞类型的迅速减少。同时,Fcγr介导的吞噬和Fcε RI信号通路激活T细胞可能是通过耐药组CSMD1、cadherin等基因表达上调。这些结果为进一步深入的实验分析提供了理论参考。
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