PhiC31整合酶作用机制及应用

根据同源性及催化机制的不同，可以将位点特异整合酶分为２类:
酪氨酸类整合酶：Cre/Loxp、FLP、P1噬菌体等；
丝氨酸类整合酶：PhiC31、R4、Tn4等；
有研究表明，酪氨酸类整合酶的整合效率低于丝氨酸类整合酶。

链霉菌噬菌体PhiC31整合酶是一种位点特异整合酶（Site-specific recombinase, SSR），其能够精确并单向的促进attP位点与attB位点的重组，是继Cre/Loxp、FLP之后又一个倍受关注的位点特异整合酶，该整合酶已经成为基因治疗、转基因研究等领域的常用技术手段。
技术特点：φC31 整合酶系统在促进DNA链之间位点的特异重组时，不需要借助外援能量或辅助因子，不仅能实现位点的特异整合，而且具有很高的整合效率。具有介导外源基因整合效率高、胜任大片段基因整合、整合的外源基因可长期高效表达等优点。

一、序列特征

研究表明，attB 和attP 最小活性序列长度分别为34bp 和39 bp

attB：5'- GTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCG -3'
attP：5'- CCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGG -3'

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二、工作机制

整合酶phiC31识别到attP和attB后会分别从两序列的中心位置TTG后的碱基开始切割双链DNA并旋转180°，之后再连接起来后形成36bp的attL和37bp的attR。由于phiC31整合酶具有attP和attB最小活性序列短， DNA装载能力强，以及异形序列attP和attB交换整合后形成attL和attR不会被phiC31识别催化发生再次整合等突出优势，该系统已经在包括植物、哺乳动物、昆虫等多个物种的位点特异整合研究中得到广泛的应用，并在基因操作和遗传工程研究中发挥了重要的作用，成为开展基因操作的强有力工具。

PhiC31 integrase

三、 整合结果

• 当att位点位于不同的DNA序列中时，PhiC31 位点特异整合酶会促进att位点间的整合；
• 当att位点位于同一个DNA序列中时，在PhiC31 位点特异整合酶的作用下，att位点间会发生整合，进而发生基因删除或者倒置。

究竟是删除还是倒置，跟attB与attP序列的方向有关！！！

位点特异重组酶phiC31能催化其特异识别序列attB与attP之间发生不可逆的重组交换，当 attB与attP同向排列时，会在phiC31的催化下发生重组交换并删除两者之间的DNA序列，而当attB与attP反向排列时，会在phiC31的催化下发生重组交换并翻转两者之间的DNA序列。

（1）如果attB和attP序列反向排列（头对头的形式），则发生倒置。

相向排列的attB和attP

（2）如果attB和attP序列同向排列，则发生剪切（删除）。
看步骤2

同向排列的attB和attP

四、改造变异

传统的phiC31/att system，attP存在于宿主，attB存在于donor。如果宿主和donor都含有两个attB/attP，会怎样？
见上图
①：插入了3xP3-EGFP-SV40-attB2；
②：由于attB2和attP2同向，会删除掉两者之间的序列。
最后会插入目的元件，而不会残留质粒骨架sequence在基因组上面。

Frequently Asked Questions

1. 为什么昆虫用Cre/loxP系统的案例偏少？
   The Escherichia coli phage P1 Cre/loxP site-specific recombination system is currently the most widely applied tool for genome manipulation in the mouse, but the optimum temperature of 37 ℃ for Cre recombinase (Buchholz et al., 1996) is higher than the optimum temperatures for most insect species (approximately 25-32 ℃), and the Cre/loxP system is thus rarely used in insects compared with other organisms such as mammals.

2. phiC31/att system可以插入多大片段？
   Venken et al. (2006) successfully inserted a transgenic bacterial artificial chromosome
   (BAC) of 133 kb into the intended recipient site and rescued the associated phenotype in D. melanogaster using the phiC31/att system

3. 多数文献载体含有单一的attB/attP，也有含有两个attB/attP？有何异同？
   单一PhiC31介导的RMCE存在缺点，如非预期的载体骨架整合、donor基因盒被切割以及反向
   置入等问题。双整合酶介导的基因盒交换(dualintegrasecassetteexchange,DICE)可使目的基因精确插入预定位点,而且保持方向不变,规避了单一PhiC31介导的RMCE缺点。

参考文献：

1. 位点特异整合酶φC31的作用机制及应用
2. φC31整合酶系统介导的位点特异性整合研究进展
   3.适用于家蚕表达的特异性整合酶phiC31及其表达调控系统和应用的制作方法
3. PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换
   5.Improvement of a phiC31 integrase-based gene delivery system that confers high and continuous transgene expression
4. In vivo site-specific integration of transgene in silkworm via PhiC31 integrase-mediated cassette exchange