常用测序机器及其原理-1（自学用）
常用的测序机器包括Sanger测序、二代测序（如Illumina测序）、三代测序（如PacBio和Nanopore测序）等
1. Sanger测序（第一代测序，双脱氧法测序）
原理：Sanger测序使用特定的碱基终止反应。即在DNA合成过程中加入了少量的链终止核苷酸（ddNTPs），这些核苷酸一旦加入到DNA链中，就会阻止链的延伸，产生不同长度的DNA片段。每种碱基（A、T、C、G）都带有不同的荧光标签，通过电泳分离并读取荧光信号，可以确定DNA序列。
设置四个反应体系1-4，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP、一定比例的ddNTP（带有放射性标记）例如1中是ddATP，它就负责测定T碱基的位置；依次2是ddCTP，3是ddTTP， 4是ddGTP。假如扩增过程中ddATP遇到了T位点，就结合并终止（因为ddNTP的2‘和3'都没有羟基）,一段时间内大量的ddNTP会结合完所有测序位点。最后利用凝胶电泳和放射自显影只能看到带有荧光标记的ddNTP，他们的排列顺序先利用电泳条带前后关系确定下，再用A-T, T-A, C-G, G-C关系反转一下，就能知道我们的测序序列。
一代测序技术的主要特点就是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，二三代所不能及），但它的通量低，成本高。目前一代测序在验证序列（就是平时送公司测序返回来自己blast的那些）以及验证基因组组装完整性方面都是金标准。
2. 二代测序
2.1 Illumina
Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生。其中Roche公司的454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。
其中Illumina市场规模占到75%以上，主要包括Miseq，Hiseq。下面👇就主要介绍它的PE（Pair End双端）测序原理：
2.1.1 名词：
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，其内表面是做了专门的化学修饰（共价键连接）的（将2种DNA引物种在玻璃表面，与测序的接头序列相互补），试剂添加、洗脱等过程的发生位置
DNA引物种在玻璃表面，与测序的接头序列相互补
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
index(barcode)：一个lane通常要测多个样品，每个样品都加上特定的序列标签，用于区分不同样品。
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
2.1.2 文库构建
1.超声断裂
2. 平末端
打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是。
3. 3’ 端加A 尾（Klenow酶）
4. 连接酶连接特定接头
2.1.3 桥式PCR
将已经构建好的文库，种到芯片上去，然后进行扩增的一个过程
1.加入DNA文库，形成与芯片引物结合状态
2.加入d NTP和聚合酶，合成新的DNA
3.加入NaOH溶液。解离DNA双链
4. 没有和芯片共价（原来的链）的DNA单链解离冲走
5. 加入中性溶液，形成桥接
互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的）就像下图这样（摘自illumina官网）目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是下图中的Forward Strand，它和我们的模版链是一致的。我们后来测序只用这一半。
6. 加入dNTP和聚合酶，形成桥状DNA
7. 加入NaOH溶液，解离DNA
8. 重复加入中和液，NaOH，形成cluster
9. 解链：
桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。这一次不再进行复制，而是利用一种酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane 上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链即Forward Strand。
2.1.4 目标 RNA 测序
1.先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能激发不同颜色】；
2.在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基，这一个循环就能测定flowcell上成千上万的cluster，这就实现了高通量。
3.再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列。
4.因为一个cluster的序列是一样的，所以理论上cluster的荧光颜色应该一致。
2.1.5 index测序
上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。
2.1.6 双端测序之Reverse Strand
洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。
思考？
为什么Illumina测序会有长度限制呢？
1.测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。通俗一点讲，比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，50个绿色，这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成。
2.测序过程中，使用的碱基是特殊处理的，有一个非常大的荧光基团修饰。在使用DNA ploymerase的时候，酶的状态也会受到底物的影响，越来越差。
数据产生
Hiseq2000测序仪
测序仪搭配了两个flowcell，简称双流动槽。比较经典的Hiseq2500一次能产出700-800Gb数据（此处Gb为测序碱基数，不同于字节数的Gb）
数据量=单端reads长度 * 单端reads个数 * 2（PE)
测序深度=数据量大小/ 参考基因组大小
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