质粒转染实验成功的秘密因素大公开！

和普通分子生物学实验不同，质粒转染实验的影响因素可谓是多方面的。常常有刚接触到细胞转染的新手仅凭一次实验的成功就觉得自己掌握了这个实验，但后续又往往无法重复出原来的实验结果，有人说这叫“新手保护期”，也有人说成功的转染需要“天时地利人和”。其实不然，质粒转染并没有那么玄学，只是很多研究者并没有真正的了解该实验，没有把握住实验中的各个要素。因此，想以近些年来我们实验室做转染的一些经验，来跟大家做一下分享，也希望能够帮助到各位小伙伴快速从质粒转染的科研小白成长为高手。

简单来说，影响质粒转染结果的因素可归结为三方面：质粒、细胞以及转染试剂。

一、质粒

质粒本身的质量是研究者最容易忽略的部分，也是我们在排查实验失败原因时很少第一时间考虑到的方面，但其实真的非常重要，因此我们第一部分来讲讲质粒方面的注意点：

质粒构建：研究者一般通过两种途径获得目的质粒，自己构建或由生物公司构建。质粒构建中载体的选择会较大影响后续重组质粒转染的结果，需要综合考虑载体大小、启动子属性、复制性能、标签序列等因素。如自己构建，需注意多查阅文献资料选择最适载体；如找公司合成，建议研究者选择质粒合成经验丰富的公司进行构建合成，如百代生物、吉玛生物等。

质粒大小：质粒大小会影响转染效率，一般来说4000-10000bp的质粒大小比较适合于细胞转染，较大的质粒转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。

质粒纯度：质粒纯度不够，其含有的杂质特别是宿主核酸、菌体蛋白、内毒素等都会严重影响质粒转染的结果。其机理是，菌体蛋白、宿主核酸、内毒素均可与转染试剂紧密结合，从而大幅降低目标质粒的转染效率，菌体蛋白、内毒素还会导致细胞死亡。研究者应选择纯化效果较好的质粒提取试剂，如Qiagen、BIOG的去内毒素中大量质粒提取试剂等，同时还需对提取后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，看是否有大肠杆菌基因组DNA的污染，这是十分必要的，如有基因组DNA污染将影响质粒转染的效率。

质粒浓度：转染用的质粒要保证其浓度，正常情况下，用于细胞转染的质粒浓度应大于500ng/uL。一般来说，较高浓度的质粒可以提高转染效率，但过高的浓度可能会导致质粒凝聚和细胞毒性。

质粒量：初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂，也可进行梯度摸索最佳转染条件。

二、细胞

细胞的种类繁多，但转染难易程度却参差不齐，这一点相信很多研究者也有相同体会，因此，我们能做好的就是在每次实验时，尽可能的使细胞其他方面的因素对质粒转染的影响降到最低。

细胞状态：建议使用冻存复苏后，已传了两三代的细胞，确保细胞生长旺盛，形态正常，无支原体、黑胶虫等污染问题；

细胞密度：市面上大多数质粒转染试剂建议的转染密度为70-90%，考虑到细胞增殖的问题，研究者在转染前一天铺板时可铺至60%左右。

培养基和抗生素：有研究发现，使用不同细胞培养基转染时，转染效率也存在差异，这点研究者可以通过检索文献参考相关细胞转染时所使用的培养基来进行实验；抗生素一般用来防止细胞受污染，在细胞培养传代时对细胞是无害的，但在质粒转染实验过程中，由于转染试剂会增加细胞膜的通透性，抗生素就很有可能进入到细胞中影响细胞的活性，甚至导致细胞死亡，因此建议整个过程中不添加抗生素。

三、转染试剂

大多数人只知道质粒转染试剂的转染性能有高低，其实与之相关的影响因素也不少，原因是不同品牌所研发的转染试剂成分不同，如赛默飞的lipofectamine2000、lipofectamine3000是以阳离子脂质体为主要成分，polyplus的JetPEI是以聚乙烯亚胺衍生物为主要成分，这两种成分几乎是代表了市面上百分之90以上的质粒转染试剂，然而还有一种成分是可降解生物纳米材料，以这种成分为代表的是百代生物的Lipofect5000质粒转染试剂，不同成分就意味着质粒转染性能、对血清的兼容性、转染复合物配制以及换液要求都有所差别，如果研究者只是按照自己的习惯进行转染而忽略这些细节，那么再好的转染试剂也无法发挥出它最好的效果。

质粒转染性能

使用过多款质粒转染试剂以后，我们发现对于一些易转细胞系，各品牌的转染效果差异并不大，如AAV293细胞，我们分别用lipofectamine3000、JetPEI以及lipofect5000进行了GFP质粒的转染，24h荧光图如下所示，均可达到90%以上的转染效率：

但在某些癌细胞的质粒转染上，不同试剂的转染效率差异则比较大，以人胃腺癌细胞AGS细胞和人结肠癌细胞HCT116细胞为例，我们发现这种以可降解纳米材料研发的Lipofect5000，质粒转染效果出乎意料，均显著优于两款国外大牌试剂。

AGS细胞

Lipofect5000转GFP质粒到AGS细胞中，24h观察转染阳性率达90%以上，而lipofectamine3000和JetPEI的转染阳性率在10%-20%以内。

HCT116细胞

Lipofect5000转GFP质粒到HCT116细胞中，24h观察转染阳性率达80%以上，lipofectamine3000和JetPEI的转染阳性率均在50%左右。

以上这些实验结果，着实让我们对国产试剂刮目相看，便想在之前一直用lipofectamine3000没有转成功的SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）上尝试一下，该细胞的转染难度比较大，lipofectamine3000转染效率最高可达30%。我们按照lipofect5000说明书，在SH-SY5Y细胞中进行了GFP质粒转染，绿色荧光蛋白表达情况如下图所示，转染效率可达60%以上！

对血清的兼容性

血清是细胞生长的主要营养成分，但对于脂质体介导的细胞转染来说，血清会影响质粒转染效率。研究表明，血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。PEI类的转染试剂对血清也具有类似敏感性。

简单来说，使用阳离子脂质体或聚乙烯亚胺成分的转染试剂对血清的兼容性较差，但Lipofect5000非上述成分研发，对血清具有良好的兼容性，因此可适用于含血清培养基培养细胞的转染，血清并不会影响转染效果。

转染复合物配制

市面上绝大多数质粒转染试剂在转染复合物的配制这步中，要求使用无血清培养基或opti-MEM减血清培养基，但lipofect5000中配置了专研的Trans Buffer，可完全替代上述两种培养基进行复合物的配制，这点非常便利。总之，不同质粒转染试剂有不同的要求，新手研究者拿到转染试剂

换液要求

换液要求主要是为了避免血清对细胞活性或转染复合物形成带来的影响，具体影响可参考上文中“对血清兼容性”部分的描述哦。如果使用阳离子脂质体或pei成分的转染试剂则最好按照说明书要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h在更换成有血清培养基，这其实也是为了减轻转染造成的细胞毒性。如果使用可降解生物纳米材料成分的质粒转染试剂则无需换液，细胞毒性很低，不换液也不会影响转染效果，但可根据血清消耗情况及时给细胞补充营养成分，以保证更佳的细胞活力和更高的转染效率。