β-半乳糖苷酶检测细胞衰老的具体操作方法是什么？

对衰老相关β-半乳糖苷酶的检测是有效检测细胞衰老的经典方法。X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）是β-半乳糖苷酶的底物，X-Gal本身无色，经β-半乳糖苷酶水解后产生半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。利用X-Gal的这个特点，可以间接对β-半乳糖苷酶的活性进行测定。衰老细胞中的溶酶体内容物通常增多，使得溶酶体酶β-半乳糖苷酶的活性升高，故可以X-Gal作为底物对细胞衰老的情况进行检测。

（1）细胞接种前在6孔培养板中预先放置灭菌的细胞片，每孔加入1×10^5个细胞，37℃ 5% CO2条件下培养过夜，使细胞在细胞片上生长。

（2）在超净工作台中吸弃6孔培养板中的培养液，加入×1PBS，洗涤细胞1次，随后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室温条件下固定3~5分钟。

（3）吸弃2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1PBS，洗涤细胞3次，每次3分钟。

（4）吸弃×1PBS，加X-Gal溶液以浸没细胞片为宜，37℃孵育4~8小时或过夜，用保鲜膜包被6孔培养板以防染液蒸发。

（5）取出细胞爬片，去离子水冲洗2次，再次用固定液固定4分钟，流水轻轻冲洗。

（6）将细胞爬片按此顺序脱水、透明∶95%酒精I（2分钟）→95%酒精Ⅱ（2分钟）→100%酒精I（2分钟）→100%酒精I（5分钟）→二甲苯I（2分钟）→二甲苯Ⅱ（2分钟）。

（7）中性树胶封片。

（8）在普通光学显微镜下观察衰老细胞形态。

每张片子镜下计数400个细胞，确定X-Gal染色阳性细胞（衰老细胞）在细胞群体中的所占的百分比即衰老细胞率（蓝染细胞数/总计细胞数×100%）。

注意事项

（1 ）X-Gal溶液需要现用现配。

（2）细胞固定时间过长或固定之后清洗不干净，均会影响后续的酶反应。