在科研领域，准确测定大鼠体内维生素 D3（VD3）的含量对于深入研究相关生理机制至关重要。大鼠维生素 D3（VD3）定量检测试剂盒（ELISA）为科研工作者提供了一种可靠的检测工具。

实验原理

本试剂盒采用竞争 ELISA 法进行检测。预先包被维生素 D3（VD3）抗体的微孔板就像一个 “检测平台”，在这个平台上，样本 / 校准品和 Asaay Diluent 依次加入。经过温育和洗涤步骤后，再加入 SA - HRP 继续温育。再次洗涤后，加入底物 TMB 进行显色反应。在室温下，TMB 显色完成后，加入终止液终止反应，此时就可以读取 OD 值了。有趣的是，OD 值的高低与样品中的维生素 D3（VD3）含量呈负相关关系。本试剂盒具有诸多优点，如灵敏度高、特异性强、重复性好，操作过程简单且快速，能够可靠地检测出血清中维生素 D3（VD3）的增减变化。

试剂盒限制性

1. 本试剂盒仅用于科研目的，绝不能用于临床诊断。
2. 请在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品切勿使用。
3. 严禁与其他厂家的试剂盒或组分混合使用。
4. 若样品需要稀释，可使用 PBS（PH7.4）进行稀释。
5. 若样本值高于最高标准品浓度值，需将样本适当稀释后再重新测定。
6. 待测样本中可能存在的异嗜抗体可能会干扰检测结果，检测前务必排除该因素。
7. 通过其他方法得到的检测结果与本试剂盒测定结果不具有直接可比性。

技术提示

1. 混合蛋白溶液时，要尽量避免产生气泡，以免影响实验结果。
2. 加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应采用悬臂加样的方式，防止交叉污染。
3. 合适的温育时间和充分的洗涤步骤是保证实验结果准确性的必要条件，务必严格按照要求操作。
4. 使用自动洗板机时，加入一个 30 秒浸泡的步骤，有助于提高检测精度。
5. 底物溶液正常应为无色液体，若在保存过程中变为蓝色，说明底物溶液已经失效，不可再使用。
6. 终止液的加样顺序应与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色的底物产物会迅速变为黄色。
7. 实验中用剩的板条，应立即放回自封袋中密封，在低温干燥的环境下保存。
8. 所有液体组分在使用前要充分摇匀，并且严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒应保存在 2 - 8 度的环境中，过期试剂盒严禁使用。本试剂盒包含以下组分：

1. 校准品：0.5ml / 管 * 6 管，由抗原配制的 6 个浓度标准品，浓度依次为 48、24、12、6、3、0ng/mL。
2. 包被微孔板：有 96T/48T 两种规格，预包被固相抗体。
3. SA - HRP：12mL，为 HRP 标记物。
4. Asaay Diluent：12mL，用于分离 VD3 与结合蛋白。
5. TMB：12mL，TMB 工作液。
6. 终止液：12mL，2mol/L 稀释液。
7. 20× 浓缩洗涤液：30mL，含 0.15% Tween20 的 PBS。
8. 说明书：1 份。
9. 自封袋：1 个。
10. 不干胶：2 片。

需要注意的是，本品必须按照具有潜在感染性的物品进行处理，处理过程应遵循通用的安全措施。

其他用品

为顺利完成实验，还需准备以下物品：

1. 酶标仪（450nm）
2. 精密移液器及一次性吸头
3. 蒸馏水
4. 洗瓶或者自动洗板机
5. 37℃水浴锅或恒温箱
6. 500ml 量筒

生物安全

1. 检测过程必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2. 试剂盒的液体组分中含有 proclin - 300 防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，操作时应避免吸入烟雾以及与皮肤接触。
3. 底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，务必避免吸入烟雾。
4. 实验过程中应戴上防护手套，实验完成后要彻底洗手。

样品的采集和储存

样本类型和采集

以下是样品采集的一般指南，所有样本采集过程中严禁使用叠氮钠做为防腐剂。

1. 细胞培养上清：在 4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，将上清液保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
2. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，在 4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
3. 血浆：可使用肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂。在 4000rpm 条件下离心 20 分钟取上清，血浆同样保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
4. 组织：用预冷的 PBS (0.01 M,pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。按照 1: 9 的重量体积比（可根据实验需要适当调整，并做好记录，推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂），将剪碎的组织与 PBS 加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为进一步裂解组织细胞，可对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液在 5000×g 离心 5 - 10 分钟，取上清检测。

样本保存和稳定性

样本在 2 - 8℃条件下，可以储存 72h；若在 - 20℃条件下，则可储存 6 个月。若样本收集后不能一次检测完，应按一次用量分装冻存，避免反复冻融。使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

检验方法操作程序

1. 将各种试剂移至室温平衡两小时。取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水按 1：20 的比例稀释，充分混匀后备用。
2. 从密封袋中取出预包被板，设置一个空白对照孔，此孔不加任何液体。每个校准品设 2 孔，每孔加入对应校准品 15μl；其余每个检测孔直接加入待测血清或质控品 15μl。
3. 除空白孔外，所有孔加入 Asaay Diluent 100μl，轻轻混匀后，贴上封板膜，放置在 37℃环境中温育 60 分钟。
4. 洗板操作：
   1. 手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置 10 秒后甩干，重复 3 次，最后拍干。
   2. 洗板机洗板：选择洗涤 3 次的程序洗板后拍干。
5. 每孔加入 SA - HRP 100μl（空白对照孔除外），混匀后，再次贴上封板膜，置于 37℃温育 30 分钟。
6. 重复第 4 步的洗板操作。
7. 每孔加入 TMB 100μl，振荡混匀后，放置在 37℃避光环境中显色 15 分钟。之后，每孔加入终止液 100μl。使用酶标仪读数，选择波长 450nm，先用空白对照孔调零点，然后测定各孔光密度值（OD 值）。

结果计算

检测完成后，以标准品浓度作为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl）的方法，创建标准曲线方程。通过样本的吸光度（OD 值），利用该方程计算出样品的浓度值。若样品被稀释，通过上述方法测得的浓度值需乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。（示意图仅供参考）

试剂盒性能指标

1. 物理性能：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；所有组分应无包装破损，各组分装量不少于组分表中要求。
2. 剂量反应曲线线性：用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），剂量 - 反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于 0.9900。
3. 精密度：
   1. 批内精密度：对三组已知的高、中、低浓度样品，在同一个板块内进行二十次精度评估，批内变异系数 CV% 小于 15%。
   2. 批间精密度：对三组已知的高、中、低浓度样品，在不同板块内进行二十次精度评估，批间变异系数 CV% 小于 15%。
4. 灵敏度：最低检出限应不高于 0.1ng/mL。
5. 回收率：对三组已知的高、中、低浓度样品，在同一个板块内进行五次回收率评估，回收率在 85% - 115% 之间。
6. 稳定性：在 2℃ - 8℃保存，有效期为 6 个月。
7. 检测范围：3 ng/mL – 48 ng/mL