HE染色法检测凋亡细胞的原理及方法是什么？

苏木素-伊红染色法是一种用普通光学显微镜观察凋亡细胞形态学特征的简便方法。细胞凋亡时主要的形态学变化为细胞体积变小，胞质浓缩，染色质高度凝集、边缘化，呈新月状，随后染色质裂解成大小不等的块状，核膜裂解，细胞以类似胞吐的方式形成凋亡小体。苏木素容易被氧化，其氧化产物苏木红是真正的染料，苏木红与铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精，呈碱性。带负电荷的脱氧核糖核酸根和带正电荷的蓝色色精进行极性吸附而完成细胞核的染色。伊红可分为几种，如伊红Y和伊红B等。伊红Y是一种酸性红色胞质性染料，对细胞质、肌纤维及胶原纤维具有着色性，呈粉红色。细胞经HE染色后，细胞核呈蓝紫色，细胞质呈粉红色，根据凋亡细胞的形态学特征可观察细胞凋亡的情况。

石蜡组织切片的H/E染色

1)取材：组织块经10%中性福尔马林(甲醛)溶液固定后，常规石蜡包埋，制成厚4μm的石蜡组织切片。

2)将石蜡组织切片按照此顺序进行脱蜡、水化：二甲苯I(10 分钟) →二甲苯Ⅱ(10分 钟) → 100%酒精I(5 分钟) → 100%酒精Ⅱ(5分钟) →95%酒精(5分钟) →90%酒精(5分钟) → 85%酒精(5分钟)→H₂O 冲洗(1分钟)。

3)放入苏木精液染5~7分钟。

4)流水洗去附着染液，1%盐酸酒精分化1~2秒。

5)流水冲洗10分钟蓝化，使切片由淡红色变为灰蓝色。

6)放入伊红染液中2~5秒。

7)放入95%酒精I(2 分钟) →95%酒精Ⅱ(2分钟) → 100%酒精I(2 分钟) → 100%酒精I (5分钟) →二甲苯I(2 分钟)→二甲苯Ⅱ(2分钟)中脱水、透明。

8)中性树胶封片。

9)在普通光学显微镜下观察凋亡细胞形态。

贴壁细胞的H/E染色

1）对于贴壁生长的细胞，让其在盖玻片上爬行生长。

2）经药物或其他因素处理诱导细胞凋亡后，取出盖玻片，用×1 PBS轻轻洗涤，室温，3分钟×3次。

3）用4%的多聚甲醛在常温下固定20分钟或冷丙酮-20℃固定15分钟，取出细胞爬片，室温晾干，-20℃保存或直接进行染色。

4）蒸馏水浸泡细胞爬片5分钟。

5）放入苏木精液染5~7分钟。

6）流水洗去附着染液，1%盐酸酒精分化1~2秒。

7）流水冲洗10分钟蓝化，使切片由淡红色变为灰蓝色。

8）放入伊红染液中2~5秒。

9）放入95%酒精Ⅰ（2分钟）→95%酒精Ⅱ（2分钟）→100%酒精I（2分钟）→100%酒精I（5分钟）→二甲苯Ⅰ（2分钟）→二甲苯Ⅱ（2分钟）中脱水、透明。

10）中性树胶封片。

11）在普通光学显微镜下观察凋亡细胞形态。

悬浮细胞的H/E染色

1）对于悬浮生长的细胞经药物或其他因素处理诱导细胞凋亡后，置入离心管中，离心（1000rpm，5分钟），收集细胞。

2）×1 PBS洗涤细胞1~2次。

3）调整细胞数为（1~15）×104/ml，涂片或用离心甩片，4%的多聚甲醛在常温下固定20分钟或冷丙酮-20℃固定15分钟，取出细胞爬片，室温晾干，-20℃保存或直接进行染色。

4）蒸馏水浸泡细胞爬片5分钟。

5）接贴壁细胞H/E染色步骤中的5）-11）。