客户文章|DAP-seq助力揭示苹果MYB54通过调节细胞壁纤维素和果胶裂解酶依赖的防御机制以减轻病害

2024年12月11日，西北农林科技大学马锋旺-李超团队在The Plant Journal期刊（IF=6.2）发表了题为“MdMYB54 reduces disease severity caused by Fusarium solani in apple by modulating cell wall cellulose and pectate lyase-dependent defense”的研究论文，该文章借助DAP-seq技术，揭示了苹果MYB54转录因子通过调节细胞壁纤维素和果胶裂解酶依赖的防御机制以减轻病害。

研究背景

苹果是四大水果之一，但是苹果种植面临再植病 (ARD)问题，影响植株生长、果实品质和产量，这主要由尖孢镰刀菌（Fusarium solani）引起。植物进化出复杂遗传调控因子来抵抗生物和非生物胁迫，MYB 转录因子家族广泛参与植物胁迫响应，但在苹果抗F. solani中的作用及机制尚不清楚。植物细胞壁是抵御病原体入侵的第一道屏障，纤维素含量增加有助于增强植物抗病性，果胶裂解酶可触发细胞壁防御反应，但 MYB 转录因子如何通过诱导细胞壁防御反应抵抗F. solani仍有待探索。

研究结果

前期研究结果表明，MdERF114通过调控MdPRX63的转录显著增强了苹果根部对尖孢镰刀菌的抗性。作者通过Y2H（酵母双杂交系统）筛到与MdERF114的互作蛋白MdMYB54，并通过pull-down、Y2H、荧光素酶互补（Split-LUC）实验证实MdMYB54与MdERF114在体外和体内均直接相互作用。MdMYB54定位于细胞核，其启动子中存在多个与胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。且受F. solani、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）诱导，在苹果根中高表达。

图1 MdMYB54与MdERF114相互作用

为研究MdMYB54基因在苹果根对F. solani的作用，作者构建了MdMYB54-OE和MdMYB54-RNAi材料。MdMYB54-OE增强了苹果根对F.solani的抗性，表现为植株生长受抑制程度减轻、根相对电导率（REL）和丙二醛（MDA）含量降低、根活性提高、根部病斑数量和面积减少；RNAi株系则表现出相反结果。

图2 MdMYB54正向调控苹果植株对Fusarium solani的抗性

使用DAP-seq技术检测MYB54在全基因组水平上的结合位点。22%的结合位点位于基因启动子区，36%位于远端基因间区，10%位于基因下游区域，6%位于于外显子区。通过Meme分析发现两个高度富集的MdMYB54结合位点。DAP-qPCR结果显示，MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的启动子区与对照相比，富集倍数显著增加。KEGG通路富集分析显示，MdMYB54靶基因参在戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、MAPK信号通路、植物激素信号转导和植物-病原体相互作用通路中显著富集。GO分析发现，靶基因在乙烯、水杨酸和缺水响应等分子功能上显著富集，说明MdMYB54可能与胁迫响应、植物生长发育有关。

图3 MdMYB54靶基因的鉴定

电泳迁移率测定（EMSA）和酵母单杂交（Y1H）实验结果显示，MdMYB54在体内外直接与MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的启动子结合。双荧光素酶（Dual-Luc）和葡萄糖醛酸酶（GUS）实验显示，MdMYB54激活了这些基因的表达。

图4 MdMYB54对MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的转录激活作用

在F.solani处理下，MdMYB54过表达根系纤维素含量和果胶裂解酶活性显著高于野生型植株，而在MdMYB54-RNAi根系中则相反。

图5 纤维素含量和果胶裂解酶活性的测定

为了进一步研究MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12在F. solani感染中的作用，作者构建了MdCesA6-OE，MdPLL8-OE，和MdPLL12-OE材料。发现过表达MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12增强了苹果根对F. solani的抗性，表现为植株生长改善、根损伤减轻、REL和MDA含量降低、根活性提高。

图6 MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12过表达增强了苹果对F. solani的抗性

为研究MdERF114和MdMYB54的相互作用是否影响MdMYB54对MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的调控，作者进行了GUS、双荧光素酶测定实验。结果表明，MdERF114和MdMYB54之间的相互作用促进MdMYB54激活MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12启动子的激活，增强苹果对F. solani的抗性。

图7 MdERF114促进了MdMYB54与MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12启动子的结合

实验结论

MdMYB54 是苹果中抵抗F. solani的正调控因子，与MdERF114相互作用，通过直接结合并激活细胞壁相关基因MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的启动子，增强纤维素沉积和果胶裂解酶活性，提高苹果对F.solani的抗性。研究揭示了MdMYB54在F.solani感染苹果根中的调控机制，为理解其在缓解苹果再植病挑战中的作用提供了依据，为提高苹果产量和品质、培育优良砧木新品种奠定了理论基础。