人白细胞介素 6（IL-6）试剂盒（ELISA）知识小科普

人白细胞介素 6（IL-6）是一种由免疫系统细胞产生的细胞因子，在疾病状态下，其浓度可能会显著上升，比如在感染、自身免疫等疾病中。因此，检测体内的 IL-6 浓度，对于评估疾病状态、监测治疗效果具有重要意义。人白细胞介素 6（IL-6）试剂盒（ELISA）就是一种能够定量检测血清、血浆、细胞培养上清液等样本中 IL-6 浓度的工具。

基本信息

1. 货号：RX106126H
2. 规格：48T/96T
3. 检测范围：1.5→48 pg/mL
4. 特异性：与结构类似物无交叉
5. 灵敏度：<0.1 pg/mL
6. 重复性：板内变异系数均 < 10%，板间变异系数均 < 15%
7. 保存条件及有效期：2-8℃保存 6 个月。

实验原理

试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人白细胞介素 6（IL-6）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人白细胞介素 6（IL-6）校准品和待测样本，再加入另一株 HRP 标记的抗人白细胞介素 6（IL-6）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体 - 抗原 - 酶标抗体的夹心复合物。加底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪 450nm 波长上测定吸光度（OD 值），吸光度（OD 值）与待测样品中人白细胞介素 6（IL-6）的浓度正相关。通过拟合校准品曲线，就可以计算出样本中人白细胞介素 6（IL-6）的浓度。

试剂盒使用流程

1. 样本采集与储存：
   1. 细胞培养上清：4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
   2. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
   3. 血浆：用肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 条件下，离心 20 分钟取上清，血浆保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。如果样本收集后无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
   4. 组织匀浆：用预冷的 PBS（0.01M，pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1:9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液 5000×g 离心 5-10 分钟，取上清检测。
   5. 细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次。每 1×10⁶个细胞中加入 150-200μLPBS 重悬并通过反复冻融使细胞破碎（若含量很低可减少 PBS 的体积）。将提取液于 1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。
   6. 其他生物体液：1000×g 离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。
2. 试剂准备：
   1. 使用前，样本和试剂盒所有的组分都要至少复温 120min，确保充分复温到室温。
   2. 浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按 1:20 稀释，即 1 份的浓缩洗涤液，添加 19 份的蒸馏水。
   3. 底物：底物液 A 和 B，在使用前，按 1:1 体积充分混合，混合后 15 分钟内使用。
3. 操作程序：
   1. 所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
   2. 按说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
   3. 从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
   4. 设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。
   5. 除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL。
   6. 用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 60min。
   7. 揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡 30s 的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
   8. 将底物 A 和 B 按 1:1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 15min。
   9. 所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪 450nm 波长上读取各孔吸光度（OD 值）。
4. 结果计算：
   1. 以标准品浓度做为横坐标（6 个标准品孔，加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点），对应的吸光度（OD 值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。
   2. 如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

注意事项

1. 试剂盒仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2. 在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3. 不能与其他厂家的试剂盒或者组分混用。
4. 使用试剂盒配套的样品稀释液。
5. 如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6. 待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。
7. 试剂盒的液体组分中，含有 proclin-300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾，避免与皮肤接触。底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾，实验时戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
8. 试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。