电穿孔介导siRNA高效转染原代软骨细胞

摘要：本研究旨在建立一种高效电穿孔介导siRNA转染原代软骨细胞的方法，以实现基因沉默效果并维持较高的细胞存活率。通过优化电穿孔参数和使用高效电转缓冲液，成功实现了siRNA的高效转染，为基因功能研究和疾病机制探讨提供了有力工具。

引言

在生命科学研究领域，RNA干扰（RNAi）技术已成为研究基因功能和疾病机制的重要工具。小干扰RNA（siRNA）作为RNAi的关键效应分子，能够特异性地沉默目标基因的表达。然而，由于细胞类型的多样性和siRNA的自身特性，siRNA的转染过程面临诸多挑战。原代软骨细胞作为一类难以转染的细胞类型，其基因功能的研究尤为困难。因此，建立一种高效、稳定的siRNA转染原代软骨细胞的方法具有重要的科学意义和实际应用价值。

电穿孔法是一种利用短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时小孔，使外源分子能够进入细胞内的技术。该方法具有转染效率高、适用范围广等优点，尤其适用于一些难以转染的细胞类型。本研究旨在通过优化电穿孔参数和使用高效电转缓冲液，建立一种高效电穿孔介导siRNA转染原代软骨细胞的方法，以实现基因沉默效果并维持较高的细胞存活率。

材料与方法

实验材料

细胞：出生后5天的FVB品系小鼠，用于分离原代软骨细胞。

试剂：某试剂Ⅰ型胶原酶、某试剂Ⅱ型胶原酶、某试剂链丝菌蛋白酶、某品牌高效电转缓冲液、某品牌台盼蓝染色剂、某品牌pCMV-EGFP表达质粒、某品牌siRNA（对照siRNA和Sox9 siRNA）。

仪器：某品牌电穿孔仪、某品牌荧光显微镜、某品牌实时荧光定量PCR仪、某品牌Western blot分析系统。

实验方法

原代软骨细胞的分离：取出生后5天的FVB品系小鼠2只，分离四肢关节及肋软骨，加入含0.1%Ⅰ型胶原酶的DMEM培养基，置于细胞培养箱中37℃消化1小时。然后在解剖镜下刷去软骨外的软组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍后，再用0.2%Ⅱ型胶原酶37℃消化过夜。第2天，加入1mg/ml链丝菌蛋白酶继续消化3小时，期间每隔1小时吹打1次。

电穿孔转染质粒：将获取的单个软骨细胞在室温下用PBS洗两遍，计数。用电转缓冲液重悬细胞（5×10^5个细胞/100微升），每100微升电转缓冲液中加入5微克pCMV-EGFP-C1质粒，混匀后加入电转杯（2毫米间隙）中。电穿孔仪采用170V/15ms的参数进行电转。电穿孔后立刻加入1毫升已预温的高糖DMEM培养基，并转移至24孔培养皿中，取少许细胞进行台盼蓝染色计数细胞活率，其余的细胞继续培养48小时。

转染效率确定：电穿孔后48小时，在荧光显微镜下随机取10个视野，计数表达绿色荧光蛋白（发绿光）的细胞数，同时在可见光下计数细胞总数。计算转染率（%）=（发出绿色荧光的细胞数/总细胞数）×100%。

siRNA转染及基因沉默效果的评估：将处理得到的原代软骨细胞，用电转缓冲液重悬细胞（5×10^5个细胞/100微升），在每100微升电转缓冲液中加入5微升10微摩尔/升的对照siRNA或Sox9 siRNA，混匀后加入电转杯（2毫米间隙）中，选择170V/15ms进行电转，电转后加入培养基培养48小时。收获细胞用常规方法提取总RNA和总蛋白，进行real-time PCR以及Western blot法检测分析Sox9的mRNA和蛋白表达量。

real-time PCR分析：将总RNA用DNAase处理后反转录成cDNA，然后采用SYBR Green反应体系进行real-time PCR分析。

Western blot法分析：将得到的总蛋白定量后进行裂解变性，经10%SDS-PAGE电泳分离后，转至硝酸纤维素膜上，以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1小时后沿60kDa marker处裁开，分别加入一抗Sox9抗体与β-actin抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5分钟，分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1小时，TBST洗膜3次后，化学曝光显影。并用随机附带软件对目的条带进行灰度值扫描，计算出Sox9与内参β-actin的灰度值比值，进行蛋白的半定量分析。

实验结果

细胞存活率：电穿孔后原代软骨细胞的存活率大于80%，表明优化后的电穿孔参数对细胞损伤较小，能够维持较高的细胞存活率。

质粒转染效率：质粒的转染效率达到37.3%±5.2%，说明高效电转缓冲液和优化的电穿孔参数能够提高质粒的转染效率。

siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平：转染Sox9 siRNA后，原代软骨细胞中的Sox9 mRNA和蛋白表达水平分别下调了75%和66%，达到了理想的基因沉默效果。

讨论

电穿孔参数的选择：电穿孔参数的选择是影响转染效率的关键因素。本研究通过优化电穿孔参数，如电压、脉冲时间和脉冲次数等，成功实现了siRNA的高效转染。同时，细胞类型、细胞密度、siRNA的浓度等也会对转染效果产生影响，需要在实验过程中进行优化。

链丝菌蛋白酶的作用：原代软骨细胞能分泌多种细胞外基质，这些细胞外基质在软骨细胞周围形成较致密的结构，影响电穿孔的效率。本研究使用链丝菌蛋白酶对软骨细胞进行进一步消化，并通过间断吹打促使其细胞外基质的酶解，从而提高了电穿孔的效率。

高效电转缓冲液的应用：高效电转缓冲液能够提高一些普遍认为难以电转的细胞的存活率与转染效率。本研究选用的高效电转缓冲液适用于原代软骨细胞，能够在保证较高细胞存活率的同时达到满意的RNAi效果。

siRNA的选择与设计：siRNA的序列设计是实验成功的基础。本研究选择了针对Sox9基因的siRNA，并保证了其二级结构和热力学稳定性，从而提高了基因沉默效率。同时，siRNA的浓度和转染时间也会影响转染效果，需要在实验过程中进行优化。

策略与创新

策略：本研究通过优化电穿孔参数、使用高效电转缓冲液和链丝菌蛋白酶消化等方法，成功建立了高效电穿孔介导siRNA转染原代软骨细胞的方法。该方法具有转染效率高、细胞存活率高等优点，为基因功能研究和疾病机制探讨提供了有力工具。

创新：本研究首次将电穿孔法应用于原代软骨细胞的siRNA转染，并成功实现了高效转染和基因沉默。同时，通过优化实验条件和方法，提高了转染效率和细胞存活率，为其他难以转染的细胞类型提供了借鉴和参考。

应用前景

本研究建立的高效电穿孔介导siRNA转染原代软骨细胞的方法具有广泛的应用前景。首先，该方法可以用于研究软骨细胞相关基因的功能和调控机制，为软骨疾病的治疗提供理论基础。其次，该方法还可以用于筛选和鉴定针对软骨疾病的潜在药物靶点，为药物研发提供有力支持。此外，该方法还可以扩展到其他难以转染的细胞类型，为生命科学研究和疾病机制探讨提供新的思路和方法。

结论

本研究成功建立了高效电穿孔介导siRNA转染原代软骨细胞的方法，实现了基因沉默效果并维持了较高的细胞存活率。通过优化电穿孔参数、使用高效电转缓冲液和链丝菌蛋白酶消化等方法，提高了转染效率和细胞存活率。该方法具有广泛的应用前景，可以用于研究软骨细胞相关基因的功能和调控机制，为软骨疾病的治疗和药物研发提供有力支持。同时，该方法还可以扩展到其他难以转染的细胞类型，为生命科学研究和疾病机制探讨提供新的思路和方法。