一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）实验操作原理

原理

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧尿苷三磷酸核苷酸（dUTP）和荧光素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）提供实验所需的全套试剂组分以及优化的实验方案，适用于荧光酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪。适用于如下样品类型：贴壁细胞，悬浮细胞，石蜡包埋组织切片，冰冻切片。荧光信号检测通道为红色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

自备耗材

·离心机，荧光显微镜

·96孔细胞板，可调节式移液枪及枪头，10mM Tris pH7.5，磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）

·4%多聚甲醛，去离子水，组织自发荧光淬灭剂

试剂准备

Working Label Mix Orange：根据实际用量，用Probe Diulent将Label Mix Orange稀释20倍得到Working Label Mix Orange，未用完的Working Label Mix Orange于-20℃避光分装保存3个月，避免反复冻融。

DAPI (1×)：根据实际用量，用PBS将DAPI (500×)稀释成DAPI (1×)。

TritonX-100 (0.3%)：根据实际用量，用PBS将100% TritonX-100稀释成0.3% TritonX-100。

1×Equilibration Buffer：流式细胞仪分析需制备1×Equilibration Buffer，根据实际用量，用去离子水将5×Equilibration Buffer稀释成1×Equilibration Buffer。

实验步骤

A. 样本制备

1. 对于贴壁细胞（通过荧光显微镜分析）

(1) 在96孔板进行细胞培养，至少24 h。通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照组细胞。

(2) 除去培养基，在室温下用50 µL 4%多聚甲醛固定细胞30 min。

(3) 除去固定液并用200 µL PBS浸洗3次，每次5 min。

(4) 固定后，每孔添加50 µL 0.3%Triton X-100，并在室温下孵育30 min。

(5) 除去通透剂，用50 µL BSA Working Solution洗涤细胞3次。进行荧光显微镜分析（继续进行步骤B.1）。

注意：对于细胞爬片及其他孔板细胞，可依据实际情况调整固定液和通透剂体积。

2. 对于非贴壁细胞（通过流式细胞仪分析）

(1) 培养细胞至最佳密度（约1-2×106细胞/mL），通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。

(2) 以300 g离心并收集细胞（1-5×106），用PBS洗涤2次。

(3) 加入1 mL 4%多聚甲醛，在室温下孵育30 min。

(4) 以300 g离心细胞，除去上清液，重悬于1 mL PBS中，重复洗涤2次。

(5) 以300 g离心细胞，除去上清液，在室温下，用500 µL 0.3% Triton-X 100重悬细胞5 min使其通透（或者将细胞在100 µg/mL蛋白酶K的PBS中重悬5 min使其通透）。

(6) 以300 g离心细胞，除去上清液，重悬于1 mL PBS中。重复洗涤2次，然后进行流式细胞仪分析（继续进行步骤B.2）。

3. 对于石蜡包埋的组织切片（通过荧光显微镜分析）

(1) 将组织在二甲苯浸泡2次，每次10-20 min进行脱蜡。

(2) 通过以下步骤（按给定顺序）为组织复性：在100%乙醇中2次洗涤5 min，然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗涤3 min。

(3) 用适量的PBS浸洗样品2次，每次5 min。

(4) 排出组织中多余的PBS，并在20 µg/mL蛋白酶K（在10mM Tris pH7.5中，现配现用）溶液中室温孵育15 min。

注意：必须针对特定组织类型和厚度优化蛋白酶消化时间。蛋白酶过度消化将导致细胞结构丧失，组织切片可能会从玻片上脱落。消化不充分会导致TdT标记不彻底。

(5) 用适量的PBS浸洗样品3次，每次5 min来终止蛋白酶消化作用，进行荧光显微镜分析（继续进行步骤B.1）。

4. 对于冰冻组织切片（通过荧光显微镜分析）

(1) 将切片在玻片上干燥后，在室温下用200 µL 4%多聚甲醛固定30 min。

(2) 用适量的PBS浸洗2次，每次5 min。

(3) 去除组织中多余的PBS，并在20 µg/mL蛋白酶K（在10mM Tris pH7.5中，现配现用）溶液中室温孵育15 min。

(4) 用适量的PBS浸洗样品3次，每次5 min来终止蛋白酶消化作用，进行荧光显微镜分析（继续进行步骤B.1）。

注意：1. 组织切片会产生自发荧光，可使用组织自发荧光淬灭剂进行处理。2. 阳性对照的设置（可选），A步骤完成后，在室温条件下可用10 U/mL的DNase I（用PBS将5 U/µL的DNase I稀释成10 U/mL）消化细胞或组织10-20 min，然后再进行荧光显微镜分析。

B. TUNEL分析

1. 荧光显微镜分析

(1) 根据要分析的样品数量，在使用前准备TdT标记反应缓冲液：

反应组分每孔体积（µL）

TdT Enzyme2

Equilibration Buffer (5×)10

Working Label Mix Orange5

去离子水33

总体积50

注意：配制TdT标记反应缓冲液之前，将各组分平衡至室温，Equilibration Buffer (5×)母液因低温保存，会出现少量成分析出的现象，请颠倒混匀后使用。Equilibration Buffer (5×)中含有高毒性化学物质二甲胂酸钠和氯化钴，皮肤接触后，立即用大量水冲洗。万一发生事故或感到不适，请立即就医。使用时请勿饮酒，饮食或吸烟。

(2) 向每个样品中加入50 µL（96孔板推荐50 µL，24孔板推荐200 µL，切片建议添加100-200 µL盖住组织即可）反应混合物，并在湿盒中37℃下避光孵育2 h (不同的样本，可视情况调整孵育时间)。

(3) 用PBS将样品浸洗3次，每次5 min。

(4) 用1×DAPI孵育10 min对样品进行复染。

注意：如需计算凋亡细胞比例，建议复染，根据染色组织的不同，复染浓度可能需要调整。DAPI过度染色可能导致难以观察荧光素标记。

(5) 用适量的PBS浸洗样品3次，每次5 min。

(6) 对于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片等样本，可加入水性封固剂或抗荧光淬灭剂，封住盖玻片，用荧光显微镜进行观察。对于孔板、培养皿内细胞样本，加入适量PBS浸没细胞，再进行荧光显微镜拍照观察，红色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

显微镜拍照技巧：1）使用DAPI通道查找细胞位置；2）阴性对照组优先拍照，阴性对照显示荧光为非特异性染色荧光，需要通过黑白平衡进行扣除至无荧光；3）实验组或阳性组拍照，扣除与对照相同的黑白平衡，得到实验组或阳性组有效荧光。

2. 流式细胞仪分析

(1) 将细胞重悬于100 µL 1×Equilibration Buffer中，在室温下避光孵育10 min。

(2) 300 g离心细胞，除去上清液，重悬于50 µL TdT标记反应缓冲液中，在37℃下孵育2 h (不同实验操作原理的样本，可视情况调整孵育时间)，孵育期间可定时轻轻地晃动以混匀细胞。

(3) 300 g离心细胞。除去上清液，重悬于1 mL PBS中。重复洗涤2次。

(4) 重悬于200 µL 1×DAPI中，孵育10 min。

(5) 通过流式细胞仪分析细胞。

FAQ

做TUNEL凋亡检测，需要抗原修复或者冰冻修复吗？

需要先固定细胞，不需要做抗原修复，本试剂盒标记的是细胞核内的断裂基因，而不是抗原蛋白。

TUNEL检测可以和免疫荧光（IF）一起双染吗？先后顺序在怎样的？

可以和IF进行共染，建议先做TUNEL检测，再做IF。

本品是否可以替代吖啶橙染色试剂盒？

可以，吖啶橙染色试剂盒组分存在致癌性，所以用TUNEL试剂盒进行凋亡检测安全性更高。