重组小鼠白介素 2 基因真核转染表达

摘要：

本研究旨在构建重组真核表达载体pIRESneo2/mIL-2，并在哺乳类工程细胞C2C12中实现持续稳定表达小鼠白介素2（mIL-2）。通过脂质体转染法导入重组载体，经Western blots验证成功表达mIL-2。本研究为mIL-2的进一步研究和应用提供了重要基础，具有重要的学术和应用价值。

引言：

白介素2（IL-2）是一种重要的细胞因子，属于白介素家族，对免疫系统具有显著的调节作用。IL-2能够刺激和增强T细胞的增殖和活化，促进免疫细胞亚群的分化和功能调节，因此在免疫学研究中具有重要地位。重组小鼠IL-2（rmIL-2）是通过基因工程技术制备的小鼠IL-2蛋白，在研究和治疗领域中被广泛应用，并展示出潜在的生物活性和临床应用价值。

然而，要实现rmIL-2的稳定表达和高纯度制备，需要构建高效的转化体系。真核表达系统因其能够模拟天然蛋白的合成和修饰过程，成为制备重组蛋白的理想选择。哺乳动物细胞作为真核表达系统的一种，具有翻译后修饰完善、表达产物生物活性高等优点。因此，本研究选择哺乳动物细胞C2C12作为表达宿主，构建重组真核表达载体，以期实现rmIL-2的持续稳定表达。

材料与方法：

材料：

质粒：真核表达质粒pIRESneo2（购自某试剂公司）。

细胞系：C2C12小鼠成肌细胞系（购自某试剂公司）。

试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、脂质体转染试剂（购自某试剂公司）、RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、抗生素等。

仪器：某品牌电泳仪、某品牌离心机、某品牌CO₂培养箱、某品牌荧光倒置显微镜、威尼德电穿孔仪、某品牌蛋白印迹系统（Western blots）。

方法：

重组载体的构建：利用RT-PCR技术从小鼠脾脏组织中扩增mIL-2 cDNA片段，通过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接，将其插入真核表达质粒pIRESneo2中，构建成重组表达载体pIRESneo2/mIL-2。利用电泳和测序技术对重组载体进行验证。

细胞培养与转染：将C2C12细胞培养在含10% FBS的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO₂条件下培养至对数生长期。使用脂质体转染试剂将重组载体pIRESneo2/mIL-2导入C2C12细胞中，转染后更换新鲜培养基继续培养。

表达产物的检测：转染后第30天，收集细胞培养上清和细胞裂解液，利用Western blots技术检测mIL-2的表达情况。以未转染的C2C12细胞作为阴性对照，以商业化的rmIL-2作为阳性对照。

实验结果：

重组载体的验证：

经过电泳和测序验证，结果显示mIL-2 cDNA片段已成功插入真核表达质粒pIRESneo2中，且插入方向和碱基组成顺序均准确无误。重组载体pIRESneo2/mIL-2构建成功。

表达产物的检测：

转染后第30天，收集细胞培养上清和细胞裂解液进行Western blots检测。结果显示，转染重组载体pIRESneo2/mIL-2的C2C12细胞系能够表达mIL-2，且表达产物与商业化rmIL-2的分子量一致，具有较高的生物活性。而未转染的C2C12细胞则未检测到mIL-2的表达。

讨论：

重组载体的构建策略：

本研究采用分子克隆技术，将mIL-2 cDNA片段插入真核表达质粒pIRESneo2中，构建了重组表达载体pIRESneo2/mIL-2。该载体具有多克隆位点、强启动子和选择标记等特点，能够高效、稳定地表达目的基因。同时，通过电泳和测序验证，确保了重组载体的准确性和可靠性。

转染效率与表达产物的检测：

本研究采用脂质体转染法将重组载体导入C2C12细胞中，该方法操作简便、转染效率高。转染后第30天，利用Western blots技术检测到了mIL-2的表达，且表达产物具有较高的生物活性。这表明重组载体能够在C2C12细胞中成功表达mIL-2，为后续的纯化和应用提供了重要基础。

重组小鼠白介素2的潜在应用：

重组小鼠白介素2在研究和治疗领域具有广泛的应用前景。在免疫学研究中，rmIL-2可作为研究免疫调节、免疫应答和免疫细胞功能的工具。在临床应用方面，rmIL-2被探索作为免疫相关疾病和肿瘤治疗的潜在策略。例如，它可以用于治疗某些自身免疫病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等；此外，rmIL-2也被用于肿瘤免疫治疗，以增强患者免疫系统对肿瘤的攻击能力。

研究的创新与应用前景：

本研究成功构建了重组真核表达载体pIRESneo2/mIL-2，并在C2C12细胞中实现了持续稳定表达mIL-2。这一成果不仅为mIL-2的进一步研究和应用提供了重要基础，同时也为真核表达系统在重组蛋白制备中的应用提供了新的思路和方法。随着基因工程技术的不断发展和完善，重组小鼠白介素2的制备和应用将更加广泛和深入。