负载自噬抑制小干扰RNA的聚精氨酸多肽纳米胶束抗肿瘤转移作用的初步研究

目的 制备一种负载si-Beclin1的阿霉素聚精氨酸多肽纳米胶束,考察其对前列腺癌细胞的体外抗肿瘤转移能力,并探索其可能的作用机制。方法 采用多肽固相合成法合成聚精氨酸组氨酸(HR),再与阿霉素衍生物(DOX-EMCH)通过缩合反应合成DHR,产物与L-半胱氨酸反应并纯化得到DHRss。DHRss与si-Beclin1共孵育形成聚合物胶束DHRss-B。通过透射电镜观察形态,动态光散射法测定其粒径和电位,同时考察其稳定性;在人前列腺癌细胞株PC-3细胞中,采用流式细胞术考察细胞摄取情况;采用CCK-8法检测DHRss-B抗细胞增殖能力;采用荧光显微镜观察MDC染色自噬小体的生成;采用Western blot法观察Beclin1、LC3及Paxillin蛋白的表达;采用Transwell法观察纳米胶束抗细胞侵袭能力。结果 制备的聚精氨酸多肽胶束(DHRss-B)粒径大小合适,平均粒径为(129.9±2.5)nm,电位为(25.8±1.65)mV,形态分布均匀,2～8 ℃放置96 h后稳定性良好。流式细胞结果表明,DHRss-B具有较好的细胞摄取能力;CCK-8结果显示,DHRss-B具有较强的细胞毒性。此外,MDC染色法及Western blot结果显示,DHRss-B可显著抑制阿霉素(DOX)引起的细胞自噬。抗细胞侵袭试验表明,DHRss-B具有较强的抗肿瘤转移能力,可能与抑制Paxillin蛋白的表达有关。结论 负载si-Beclinl的阿霉素聚精氨酸多肽纳米胶束具有较强的抗肿瘤转移能力,具有良好的临床应用前景。

关键词: 前列腺癌;自噬;阿霉素;抗转移

前列腺癌已成为危害男性健康的重要肿瘤之一,激素抵抗是晚期前列腺癌治疗的难题[1]。以多西他赛为基础的联合治疗是内分泌治疗失败后前列腺癌的一线化疗方法,但存在化疗耐药的问题[2-3]。目前,前列腺癌化疗耐药可能与前列腺癌细胞内自噬活性的异常升高有关[4-6]。

细胞自噬是一种细胞自我降解的过程,在适应代谢应激、保持基因组完整性及维持内环境稳定方面发挥重要作用[7-8]。在肿瘤治疗中,凋亡耐受是产生肿瘤耐药的重要机制,细胞自噬可抵抗抗肿瘤药物诱导的凋亡,促进肿瘤耐药[9-11]。因此,抑制细胞自噬可能是逆转肿瘤细胞耐药的关键。Beclin1基因也称BECN1基因,是酵母ATG6的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因[12]。Beclin1基因主要通过与III型PI3K形成复合体来调节其他ATG蛋白在自噬前体结构中定位,调节自噬活性[13]。上调Beclin1在哺乳动物中的表达能够刺激自噬的产生。研究发现,40%～75%的卵巢癌、乳腺癌及前列腺癌中存在BECN1基因的缺失性突变[14]。因此,自噬抑制可作为提高化疗疗效的重要辅助策略。采用 RNAi 技术(Beclin1siRNA)下调 Beclin1 的表达[15],通过靶向Ⅲ型PI3K通路抑制前列腺癌细胞的自噬活性,可提高其对化疗药物多西他赛(Docetaxel,DTX)的敏感性[16-18],进一步表明 Beclin1siRNA 可作为一种治疗前列腺癌的新方法。因此,如果将 Beclin1siRNA 与化疗药物共同递送到肿瘤组织,则可提高晚期前列腺癌细胞对多西他赛等化疗药物的敏感性。基于此,本研究在聚精氨酸组氨酸(HR)的组氨酸末端氨基上修饰DOX-EMCH[19],并通过半胱氨酸分子内交联形成大分子载体,与si-Beclin1共孵育形成共载胶束(DHRss-B),同时选择人前列腺癌细胞系PC-3细胞作为实验对象,探讨其体外抗肿瘤转移作用,旨在寻找一种靶向效率高、生物相容性好、毒性低的纳米载体。

1 方法

1.1 细胞系及细胞培养 人前列腺癌细胞系PC-3细胞(购自中科院上海细胞所),将RPMI1640+10%FBS+1%青霉素/链霉素于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。细胞培养严格按照细胞培养规程及无菌条件操作。

1.2 DHRss-B的制备及表征 首先,在芴甲氧羰基保护的前提下采用固相合成法[20]合成聚精氨酸组氨酸(HR)多肽,并通过反相高效液相色谱法进行纯化。接着,阿霉素衍生物(DOX-EMCH)与HR肽末端羧基通过缩合反应得到DOX-HR (DHR)。产品通过反相高效液相色谱法纯化。然后,DHR(50 mg)和L-半胱氨酸盐酸盐0.58 mg溶于1.8 ml (pH 7.0)蒸馏水,随后向混合溶液中滴加0.2 ml 5%过氧化氢溶液并搅拌,此后避光孵育12 h。反应物装入透析袋(截留分子量=1 000),在蒸馏水中室温下透析12 h,将透析后的产物冷冻干燥24 h,以获得纯化的DHRss。将获得的DHRss与si-Beclin1共孵育30 min,得到DHRss-B。采用粒径分析仪测定DHRss-B的粒径、电位。将制备的DHRss-B置于2～8 ℃条件下分别于第0、24、48、72、96小时肉眼观察外观形状,并考察其粒径、电位变化,以评价稳定性。

1.3 DHRss-B纳米胶束的体外细胞学评价

1.3.1 流式细胞术考察细胞摄取能力 采用流式细胞术考察纳米胶束在人前列腺癌细胞PC-3的摄取能力。将处于对数生长期的PC-3细胞按2×105个/孔接种到12孔板,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h。采用FAM荧光标记的si-Beclin1和DHRss纳米胶束,按照N/P=10、20、40、80的比例混合,涡旋30 s,避光孵育30 min,制备荧光素标记的DHRss-B。培养后更换为无血清培养基,之后每孔加入不同浓度的DOX、DHRss(DOX为0.5、1、2 μg/ml)和不同N/P的DHRss-B,继续培养4 h。用PBS将细胞清洗3次,胰酶消化,离心后PBS重悬。采用流式细胞仪考察细胞对纳米胶束的摄取情况。

1.3.2 CCK-8法考察纳米胶束的细胞毒性 采用CCK-8法对DHRss-B纳米胶束的细胞毒性进行考察。将处于对数生长期的人前列腺癌细胞PC-3按8×103个/孔接种到96孔板中,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h。弃去培养基,之后每孔加入不同浓度的DHRss-B纳米胶束(si-Beclin1 100 nM;DOX为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 μg/ml),继续培养24、48 h,吸掉培养基,更换为含CCK-8的新鲜培养基,继续孵育1～2 h。酶标仪450 nm测定OD值。以未处理细胞为对照,未接种细胞的孔为空白孔,计算每孔的细胞活力。

由于siRNA体内易被酶降解,因此采用转染试剂lipofectamine 2000(Lipo2000)保护si-Beclin1。将si-Beclin1与Lipo2000共同孵育以制备Si-LIP组。将新鲜配置的Si-LIP、DOX、DHRss、DHRss-B(si-Beclin1 100 nM,DOX 0.5 μg/ml)分别加入至培养孔中,继续培养48 h。通过显微镜观察不同处理后PC-3细胞的形态学变化。

1.3.3 MDC法染色观察细胞自噬情况 接种1×104个 PC-3细胞于预先加入盖玻片的24孔板中,继续培养24 h。将si-Beclin1与Lipo2000共同孵育以制备Si-LIP组。将新鲜配置的HR、Si-LIP、DOX、DHRss、DHRss-B(si-Beclin1 100 nM,DOX 0.5 μg/ml)分别加入至培养孔中,继续培养24 h,用1×wash buffer洗涤2次,加入120 μl MDC染液,室温避光染色1 h;用1×wash buffer洗涤3次,滴加50 μl抗猝灭封片液封片后,置于4 ℃避光保存,置于荧光显微镜下观察细胞自噬情况。

1.3.4 蛋白免疫印迹试验 采用蛋白免疫印迹试验考察纳米胶束对细胞自噬的影响。将处于对数生长期的人前列腺癌细胞PC-3以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔板中,孵育24 h。将新鲜配置的HR、Si-LIP、DOX、DHRss、DHRss-B (si-Beclin1 100 nM,DOX 0.5 μg/ml)分别加入至培养孔中,继续培养 24 h,收集细胞,用RIPA裂解缓冲液重悬,冰上孵育30 min。然后,收集蛋白质样本。等量的蛋白通过煮沸5 min变性,SDS-PAGE分离,转移到PVDF膜(Millipore,美国)上,用5%脱脂奶粉在室温下阻断1 h,然后用抗体P62、Beclin1、LC3、Paxillin检测。

1.3.5 纳米胶束抗侵袭作用研究 采用Transwell法考察纳米胶束抗细胞侵袭能力。Matrigel在4 ℃过夜融化,用4 ℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1 mg/ml,冰上操作,在Transwell上室底部中央垂直加入100 μl稀释后的Matrigel,37 ℃孵育1 h,使Matrigel凝成固体,将预先经DOX、DHRss、DHRss-B(si-Beclin1 100 nM;DOX 0.5 μg/ml)处理的细胞按5×103个加入到小室中,下室加入含10% FBS的培养基,37 ℃继续培养48 h。孵育结束后小心取出细胞小室,洗掉小室上层培养液,PBS清洗一遍,4%多聚甲醛固定5 min,0.5%结晶紫染色20 min,PBS清洗2次,立即用棉签擦去上层的细胞,静置风干,显微镜下观察滤膜下层的细胞。

2 结果

2.1 纳米胶束的合成与表征 粒径、电位是纳米胶束基本的考察指标。如图1A所示,DHRss-B的粒径为(129.9±2.5)nm,图1A中的DHRss-B透射电镜图显示,纳米胶束呈球形分布,大小均匀,粒径在100 nm左右,与粒径仪测得的粒径相一致。图1B为DHRss-B的电位图,电位为(25.8±1.65)mV,表明DHRss-B具有较好的分散性。图1C为DHRss-B的稳定性考察结果,结果显示,DHRss-B在48 h内平均粒径和电位无明显变化,72 h 后的平均粒径和电位略有增大,可能是由于随着时间的推移,部分纳米胶束出现凝聚现象。

图1 DHRss-B的粒径电位图和稳定性实验结果

注:A.DHRss-B的粒径和透射电镜图;B.DHRss-B的电位图;C.DHRss-B的稳定性实验结果。*与48 h粒径比较,P<0.05;#与48 h电位比较,P<0.05

2.2 纳米胶束的摄取 通过流式细胞术检测纳米胶束的细胞摄取能力。如图2A所示,PC-3细胞对DOX的摄取呈剂量依赖性。当DOX浓度为0.5、1.0、2.0 μg/ml时,DOX阳性细胞分别占45.57%、54.11%和88.66%。然而,DHRss的细胞摄取在DOX低浓度时即有较高的摄取。当DOX浓度为0.5 μg/ml时,DHRss阳性细胞率明显高于DOX的阳性细胞率(93.01% vs.45.57%,P<0.05)。采用FAM探针标记si-Beclin1,通过流式细胞术定量分析FAM-si-Beclin1的细胞摄取情况。如图2B所示,FAM荧光信号随N/P比值的增大而增大,当N/P为80时,FAM阳性细胞分别是N/P=20和N/P=40的1.79倍和1.32倍 (P<0.05),显著高于si-LIP组。这些结果表明,经细胞膜穿透肽修饰的DOX更容易进入细胞。其中,DHRss-B在N/P为40时,表现出最佳的吸收效率。

图2 PC-3细胞对DOX和DHRss-B的流式细胞摄取能力

注:A.不同DOX浓度下PC-3细胞对DOX的阳性摄取率;B.不同N/P条件下FAM-siBeclin1的阳性细胞率。*P<0.05,**P<0.01

2.3 CCK-8考察纳米胶束的细胞毒性 图3A、3B分别表示用不同浓度DOX和DHRss-B处理24 h和48 h后PC-3细胞的存活率。结果表明,培养48 h后,游离DOX对PC-3细胞的IC50值为0.95 μg/ml。DHRss-B的IC50值低于游离DOX (0.45 μg/ml vs.0.95 μg/ml,P<0.05),差异有统计学意义。结果表明,与si-Beclin1共递送可显著增强阿霉素的细胞毒性。

图3 不同DOX浓度下DHRss-B和DOX对PC-3细胞的杀伤能力

注:A:24 h;B:48 h

显微镜观察结果显示,对照组细胞密度均匀,生长状态良好,无坏死脱落;Si-LIP和HR处理后,细胞形态无明显变化;单纯DOX处理可见部分细胞皱缩变圆,该现象在DHRss-B组最为明显,脱落和死亡的细胞明显增多。见图4。

图4 显微镜观察不同处理组作用48 h后的PC-3细胞形态(40×)

2.4 荧光显微镜观察MDC染色自噬小体 不同药物组作用48 h后的MDC染色结果如图5所示。由图中可见,DOX单药组荧光最强,DHRss组次之,DHRss-B组最弱,表明化疗药物可以刺激肿瘤细胞产生自噬,共载了DOX和si-Beclin1的纳米胶束(DHRss-B)组成功在细胞内产生了抑制自噬的作用。DHRss组较DOX组弱的原因可能与纳米胶束使化疗药物达到缓释效果有关。

图5 MDC染色法观察各组细胞自噬情况(200×)

2.5 Beclin1、LC3、p62和Paxillin蛋白表达 为了探讨Beclin1在调节阿霉素诱导自噬中的作用,采用Western blot检测Beclin1、LC3和p62的表达水平。与对照组相比,DOX处理诱导自噬标记蛋白LC3II表达显著升高,p62蛋白表达显著降低(图6)。此外,LC3II/I在DHRss-B组表达较弱,p62在DHRss-B中积累,表明DOX可诱导PC-3细胞自噬,包裹si-Beclin1纳米颗粒可降低自噬发生率。从图7可以看出,Paxillin在DHRss-B组的表达水平最低,可能与DHRss-B抑制细胞自噬有关。

图6 WB法检测各组Beclin1、LC3、p62的表达水平

图7 WB法检测各组Paxillin的表达水平

2.6 抗细胞侵袭能力 DHRss-B抗细胞侵袭能力结果如图8所示。对照组细胞侵袭能力最强,DOX组具有较强的侵袭能力,DHRss-B组侵袭能力明显降低。

图8 显微镜观察各处理组细胞侵袭情况(40×)

3 讨论

本研究在前期构建了共载DOX和si-Beclin1的聚精氨酸多肽胶束抗肿瘤活性的基础上,对其抗肿瘤转移的作用进行了初步研究,旨在通过联合给药提高对转移性肿瘤的疗效。首先,制备的多肽纳米胶束具有较为合适的粒径,粒径大小均匀,可充分利用肿瘤的增强渗透滞留效应(Enhanced permeability and retention effect,EPR)[21-22],使药物富集于靶区。在细胞摄取方面,DHRss组在DOX浓度较低时,就能达到较高的细胞摄取,表明纳米胶束包裹后,增强了与细胞膜的亲和力,从而达到有效运输和高效释放的目的。

细胞毒性结果显示,随着药物浓度的增加,各给药组的细胞毒性也相应增加,表明DOX药物具有剂量依赖性的特征。在相同药物浓度下,DHRss-B的细胞毒性强于DOX,表明DHRss-B可以通过共载化疗药物DOX和基因药物si-Beclin1,实现抗肿瘤细胞增殖的作用。

通过MDC染色法和Western blot法,对Beclin1、LC3、p62蛋白的表达进行检测,结果表明,DOX组导致PC-3细胞内Beclin1及LC3II/I表达升高,可以初步推测DOX诱导细胞过度自噬,胞内自噬体急剧增多。而DHRss-B组由于si-Beclin1发挥抑制自噬作用后抵抗了DOX引起的自噬,从而使Beclin1及LCII/I的表达下降。p62的表达也验证了这一现象。

纳米多肽胶束抗细胞转移能力可从抗细胞侵袭试验及Paxillin的表达得到初步结论。Paxillin作为一种接头蛋白,能将信号从细胞外经整合素途径向细胞内传递,是细胞骨架与胞外基质连接不可缺少的交通纽带[23-25],在细胞黏附和迁移过程中起着关键作用,与肿瘤细胞转移的关系十分密切[26-27]。细胞侵袭试验结果显示,给药后各组细胞的侵袭能力下降,DHRss-B组侵袭能力最弱,表明DHRss-B具有较好的抗细胞侵袭能力。此外,经过DOX和si-Beclin1共处理后细胞自噬能力下降,Paxillin的表达下降,符合其作用原理。本研究表明,DHRss-B作为化疗基因治疗联合制剂具有较好的抗肿瘤转移能力,后期可进一步开展其抗肿瘤转移的机制研究。

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