浙大范衡宇团队acRIP-seq揭示哺乳动物mRNA乙酰化修饰ac4C形成的分子机制｜Adv Sci

图1：鉴定和验证TDP43和PCBP1/2是NAT10的接头蛋白

A.
哺乳动物RNA中N-4-乙酰胞嘧啶形成的示意图，THUMPD1和box C/D小核仁RNA（snoRNA）分别协助NAT10在tRNA和18S rRNA中产生ac4C修饰。而在mRNA ac4C形成过程中，假设的接头蛋白仍然未知。

B.
HEK293T细胞和小鼠睾丸中NAT10互作组的比较，表达N端FLAG标签的NAT10的HEK293T细胞和野生型（WT）小鼠睾丸分别用抗FLAG抗体和抗NAT10抗体进行亲和纯化，并进行质谱分析。RBPs（包括PCBP1、PCBP2和TDP43）表现出对NAT10的亲和力。

C.
共免疫沉淀（co-IP）结果显示FLAG标签的NAT10与HA标签的TDP43、PCBP1和PCBP2之间互作，这种互作对RNase A消化具有抗性作用。

D.
内源性免疫沉淀（endo-IP）结果显示TDP43、NAT10和PCBP1/2在293T细胞中自发协调。

E-F.
 N端截短的PCBP1/2构建图和验证NAT10与野生型或突变型PCBP之间互作。共免疫沉淀（co-IP）结果表明，PCBP1/2中的hnRNP
K同源性（KH）1结构域是其与NAT10结合的原因。

图3：HEK293T细胞mRNA ac4C的全转录组范围图谱

A.
ac4C RNA免疫沉淀测序分析（acRIP-seq）示意图：使用oligo (dT)15磁珠从HEK293T细胞中提取的总RNA中富集poly(A)
RNA，并进行抗ac4C抗体的亲和纯化、cDNA文库构建和进一步测序分析。

B-C.
ac4C (+) poly(A) RNA的定义：根据转录本在ac4C富集组中相对于input组和IgG富集组的富集水平，定义WT（B）和siTDP43（C）组中的ac4C (+) poly(A) RNA。只有通过与input组和IgG组的双尾Student's
t检验的转录本被选为ac4C靶标（P
< 0.05）。FC表示倍数变化。 D. 热图显示WT和siTDP43 mRNA中WT ac4C靶标富集水平，颜色从红到蓝表示富集程度从高到低。 E. IGV浏览器视图显示RRBP1（高乙酰化）、ZFP36L2（中等乙酰化）和EEF1A1（未乙酰化）转录本的转录本reads，比对到人类参考基因组（hg19）。显示acRIP、IgG富集和input组的reads。内含子/外显子（线/框）基因组结构以深蓝色显示。 F. acRIP-seq鉴定的ac4C峰簇的富集序列motif分析。上：WT 293T mRNA中的ac4C motif（P=1.5E-70）。下：siTDP43 mRNA中的ac4C motif（P=3.1E-35）。 G. ac4C修饰转录本与TDP43结合的mRNA在293T细胞中的重叠。 H. TDP43结合的ac4C转录本的富集序列motif，显示前2序列。 

图4：PCBP1/2和TDP43缺失导致野生型（WT）ac4C mRNA中ac4C丰度降低或乙酰化修饰缺失。

A.
acRIP-qPCR分析示意图：从对照组以及PCBP1/2、TDP43或NAT10敲低组中提取的RNA样本与体外转录的含有ac4C的鼠β-珠蛋白探针和无ac4C的Egfp探针混合，并通过抗ac4C抗体偶联的磁珠进行富集。通过亲和纯化富集的RNA进一步使用oligo(dT)30引物进行逆转录。

B-C.
acRIP回收的18S和5S rRNA的RT-qPCR验证结果，18S rRNA作为已知的ac4C靶标对照。

D-F.
RT-qPCR结果显示低乙酰化mRNA（GAPDH和EEF1A1）、高乙酰化mRNA（RRBP1、RBBP6和UPF3B）以及中等乙酰化mRNA（FUS、ZFP36L2和LAMP1）在acRIP富集中的差异。

G-H.
IGV浏览器视图显示含有或不含有5′-UTR乙酰化峰的ac4C靶标转录本reads数（G中的UPF3B和H中的LAMP1）在对照组的ac4C富集、IgG富集和input样本中的分布。展示5′-UTR和CDS中选定外显子的放大视图。UTR，非翻译区。CDS，编码序列。

I-J.
RT-qPCR结果显示UPF3B（I）和LAMP1（J）5′-UTR在各指示组中的富集水平变化。

图5：PCBP1/2和TDP43促进NAT10与偏好性ac4C修饰的mRNA结合

A.
内源性RNA免疫沉淀（RIP）中免疫沉淀的PCBP1、PCBP2和TDP43的Western
blot结果

B-D.
RT-qPCR结果显示PCBP1/2和TDP43以不同程度结合了非偏好性（GAPDH和EEF1A1）、高偏好性（RRBP1、RBBP6和UPF3B）和中等偏好性（FUS、ZFP36L2和LAMP1）的ac4C底物mRNA。

E-F.
RT-qPCR结果显示PCBP1/2和TDP43对偏好性乙酰化修饰的mRNA 5′-UTR的结合具有多样性。

G.
通过抗NAT10抗体进行RIP的免疫沉淀Western
blot结果：在对照组（siNC）和接头蛋白缺失组（siPCBP1/2和siTDP43）中，检测到NAT10、TDP43、PCBP1和PCBP2的免疫沉淀。当PCBP1/2缺失时，TDP43与NAT10之间的相互作用得以维持。反之亦然。

H.
NAT10/PCBP/TDP43复合体在mRNA乙酰化中的示意图：在正常情况下，NAT10/PCBP1/TDP43形成一个稳定的异源四聚体，PCBP通过其KH1结构域与NAT10结合。通过结合mRNA，PCBP1/2和TDP43将NAT10招募到偏好性的mRNA上，NAT10将乙酰基团转移到特定位点的胞嘧啶上。PCBP1/2或TDP43缺失会导致复合体不稳定，从而导致非特异性结合到非乙酰化mRNA底物上，甚至无法结合mRNA，从而导致异常的ac4C修饰。

I-K.
RT-qPCR结果显示在PCBP1/2和TDP43敲低后，NAT10与指示的偏好性乙酰化修饰mRNA之间的连接变化。

L-M.
PCBP1/2和TDP43敲低后，NAT10与UPF3B（L）和LAMP1（M）mRNA 5′-UTR之间的连接变化RT-qPCR结果。

图6：PCBP1与mRNA之间亲和影响ac4C位点偏好

A.
IGV浏览器视图显示RRBP1第14-16外显子的转录本reads，acRIP-seq中比对到人类参考基因组。根据PACES预测，RRBP1 exon15（第15外显子）的核苷酸3299–3313（CGCCAGCUCCCGCGG）含有ac4C，进一步被指定为RRBP1位点（RRBP1site）。

B.
RT-qPCR结果确认RRBP1 exon15 mRNA在对照组（siNC）中存在乙酰化，但在PCBP1/2、TDP43或NAT10耗竭后丢失。

C.
RT-qPCR结果显示内源性RIP中PCBP1与RRBP1 exon15
mRNA相互作用。

D.
RT-qPCR结果显示在TDP43和PCBP1/2敲除后，NAT10对RRBP1exon15 mRNA的亲和力分别降低或丧失。

E.
用于RNA下拉实验设计的RNA探针示意图。RRBP1位点（RRBP1site）从HEK293T cDNA克隆，并通过体外转录直接或在中性突变后掺入生物素标记尿嘧啶进行转录（将RRBP1位点中的大部分胞嘧啶替换为其他核苷酸，如C3299U、C3302G、C3305U、C3307G、C3308U、C3309A和C3311G，分别表示为RRBP1site1–WT和RRBP1site1–mut）。

F.
RNA下拉结果显示PCBP1/2对WT RRBP1位点具有特异性亲和力。

G.
RNA下拉结果显示在对照组以及PCBP1/2、TDP43和NAT10敲低后，RRBP1 exon15与NAT10/PCBP/TDP43复合体亚基之间的亲和力变化。

H.
使用胞嘧啶和乙酰化胞嘧啶探针进行RNA下拉分析示意图：WT和突变的RRBP1
exon15通过体外转录分别含有胞嘧啶和乙酰化胞嘧啶。同时加入生物素标记的尿嘧啶以进一步富集。将RNA探针与指示的细胞裂解液混合并进行亲和下拉。

I.
RNA下拉结果显示PCBP/TDP43/NAT10复合体与指示的RNA探针之间的亲和力。PCBP1特异性地与RRBP1 exon15相互作用，排除ac4C掺入，而PCBP2仅与ac4C(-) RNA相互作用。TDP43在含或不含ac4C的mRNA结合中没有差异。使用ImageJ对条带的灰度值进行定量，并以通过含有WT序列的探针下拉的对照组进行归一化。

图7：NAT10/PCBP/TDP43复合体在小鼠睾丸中mRNA乙酰化中的功能

A.
endo-IP结果显示TDP43、NAT10和PCBP1/2在小鼠睾丸中的自发协调。使用抗TDP43抗体进行endo-IP。箭头表示珠带。

B.
Western blot结果显示从小鼠睾丸中通过流式细胞分选（FACS）分离的精母细胞中TDP43的表达。LZ：细线期(leptotene)和合子期(zygotene)，PD：粗线期(pachytene)和双线期(diplotene)，MII：中期II(metaphase
II)，RS：圆形精子细胞(round spermatids），α-微管蛋白对照。

C.
通过acRIP与input组和IgG富集组之间的富集丰度定义小鼠睾丸中乙酰化的mRNA。

D.
热图显示小鼠睾丸中WT ac4C靶标的富集水平，颜色从红色到蓝色表示富集程度从高到低。

E.
通过acRIP-seq在小鼠睾丸中鉴定的ac4C峰簇的富集序列motif分析。通过MEME分析检测到CCHCAGSHC（H = C/U/A，S = C/G，P
= 1.5E-7）motif。

F.
IGV浏览器视图显示高乙酰化（Enho 3′-UTR）、中等乙酰化（Hoxd9）和未乙酰化（Eef1a1）的转录本比对到小鼠参考基因组（mm10）。显示了acRIP、IgG和input组的reads。内含子/外显子（线/框）基因组结构以深蓝色显示。

G.
RT-qPCR结果显示高乙酰化（Enho 3′-UTR）、中等乙酰化（Hoxd9）和低乙酰化mRNA（Eef1a1）的乙酰化丰度变化。

H.
RT-qPCR结果显示TDP43对小鼠睾丸中偏好性ac4C靶标mRNA的亲和力。