如何利用AAV进行帕金森疾病造模？

帕金森病的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性退化和死亡，以及细胞内路易小体的形成，α - 突触核蛋白（α - synuclein）异常聚集是路易小体的主要成分。通过 AAV 载体将与帕金森病相关的基因（如突变型 α - synuclein 基因）导入实验动物的特定脑区，使其异常表达，模拟帕金森病的病理过程。

一、前期准备

AAV 载体及目的基因选择：根据实验需求选择合适血清型的 AAV 载体，如 AAV2、AAV6、AAV9 等，不同血清型对不同组织和细胞的靶向性有所差异。目的基因常选择人 α - synuclein 基因（野生型或突变型，如 A53T、A30P 突变），将其克隆到 AAV 载体的多克隆位点。

实验动物选择：常用的实验动物为小鼠、大鼠等，一般选择健康成年动物，如 C57BL/6 小鼠。

手术器械及试剂准备：准备好脑立体定位仪、微量注射器、手术刀片、缝合线、麻醉剂（如异氟烷、戊巴比妥钠）、消毒剂（如碘伏）等。

二、AAV 病毒包装与纯化

转染：将构建好的含目的基因的 AAV 载体质粒与辅助质粒共转染到包装细胞系（如 HEK293 细胞）中，通过细胞内的一系列反应，产生携带目的基因的 AAV 病毒颗粒。

收获与纯化：培养一定时间后，收集细胞培养上清液或裂解细胞，采用超速离心、亲和层析等方法对 AAV 病毒进行纯化，测定病毒滴度。

三、脑内注射 AAV 病毒

动物麻醉：使用合适的麻醉剂对动物进行麻醉，如腹腔注射戊巴比妥钠（剂量一般为 40 - 60mg/kg），确保动物在手术过程中无疼痛反应。

固定动物：将麻醉后的动物放置在脑立体定位仪上，调整头部位置，固定好动物头部，确保后续注射位置的准确性。

确定注射位点：根据实验动物的脑图谱，确定要注射的脑区，帕金森病造模通常选择中脑黑质致密部（SNc）。使用立体定位仪确定该脑区的三维坐标（前囟后、中线旁、硬膜下深度）。

颅骨钻孔：在头皮上做一个小切口，暴露颅骨，使用牙科钻在确定的注射位点处钻一个小孔，注意不要损伤脑组织。

病毒注射：将装有 AAV 病毒溶液的微量注射器垂直插入钻孔，缓慢注射一定体积的病毒溶液（如每侧脑区注射 1 - 2μl，注射速度为 0.1 - 0.2μl/min）。注射完成后，保持注射器在原位停留几分钟，防止病毒溶液沿针道回流。

缝合伤口：拔出注射器，用缝合线缝合头皮伤口，涂抹适量的抗生素软膏，防止感染。

四、模型评估

1、行为学评估

运动功能测试：通过旷场实验观察动物的自主活动能力，包括活动距离、活动速度等；进行转棒实验，检测动物的平衡能力和运动协调能力，记录动物在转棒上的停留时间。

刻板行为观察：观察动物是否出现如舔、咬、梳理毛发等刻板行为，统计刻板行为的发生频率和持续时间。

2、神经病理学评估

组织取材：在造模后的特定时间点（如 4 - 12 周），对动物进行安乐死，迅速取出脑组织，固定在合适的固定液（如 4% 多聚甲醛）中。

切片制作：将固定好的脑组织进行脱水、透明、浸蜡等处理后，包埋在石蜡块中，使用切片机切成一定厚度（如 5 - 10μm）的切片。

染色观察：采用苏木精 - 伊红（HE）染色观察中脑黑质多巴胺能神经元的形态和数量变化；使用免疫组织化学染色检测 α - synuclein 的表达和聚集情况，以及多巴胺能神经元标志物（如酪氨酸羟化酶，TH）的表达水平，评估神经元的损伤程度。

3、神经化学评估

通过高效液相色谱（HPLC）等方法检测脑内神经递质（如多巴胺及其代谢产物）的含量变化，了解神经化学方面的改变。