m6A-seq+RNA-seq揭示KRAS突变通过调控ALKBH5翻译后修饰导致肺癌对铂类药物耐药｜JCI

KRAS基因突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中非常常见，尤其是KRAS G12C、G12V、G12D等突变类型。这些突变通常导致KRAS蛋白处于持续激活状态，促进肿瘤发生和发展。然而，KRAS突变与铂类化疗耐药之间的关系尚不清楚。m6A是真核生物mRNA上最丰富的内部修饰之一，由METTL3、METTL14等“writer”蛋白添加，由FTO和ALKBH5等“eraser”蛋白去除。m6A修饰可以调节mRNA的剪切、定位、翻译和稳定性，进而影响基因表达。已有研究表明，m6A修饰在多种癌症的发生和发展中起重要作用，但在KRAS突变型NSCLC的化疗耐药中作用尚不清楚。

近日，美国佛罗里达大学医学系Zhijian Qian团队利用m6A-seq和对应的RNA-seq研究了KRAS突变如何通过调节ALKBH5的翻译后修饰（PTMs），进而影响mRNA的m6A修饰水平，最终导致NSCLC对铂类化疗药物产生耐药性。相关研究成果以“KRAS Mutants Confer Platinum Resistance by Regulating ALKBH5 Post-translational Modifications in Lung Cancer”为题发表于《The Journal of Clinical Investigation》（JCI）。

标题：KRAS Mutants Confer Platinum Resistance by Regulating ALKBH5 Post-translational

Modifications in Lung Cancer（KRAS突变通过调节ALKBH5翻译后修饰赋予肺癌的铂类药物耐药性）

发表时间：2025年2月17日

发表期刊：《The Journal of Clinical Investigation》（JCI）

影响因子：IF 13.3/1区

技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、RNA-seq（易基因金牌技术）

本研究验证了KRAS突变赋予了NSCLC对铂类药物的耐药性。从机制上讲，KRAS突变通过激活ERK/JNK信号通路介导NSCLC细胞对铂类药物的耐药性，该通路通过调节ALKBH5的翻译后修饰（PTMs）抑制了ALKBH5的m6A去甲基化酶活性。结果，KRAS突变导致mRNA m6A甲基化水平整体增加，尤其是DDB2和XPC这两个对核苷酸切除修复至关重要的基因。这种甲基化稳定了这两个基因的mRNA，从而增强了NSCLC细胞修复铂类药物诱导的DNA损伤以及避免凋亡能力，进而导致药物耐受性。此外，通过过表达ALKBH5的SUMO化缺失突变体或药理学抑制METTL3来阻断KRAS突变诱导的m6A甲基化，能够显著增强KRAS突变型NSCLC细胞在体外和体内对铂类药物的敏感性。总体而言，本研究揭示了KRAS突变通过激活ERK/JNK/ALKBH5 PTMs诱导的m6A修饰来调节DNA损伤修复相关基因，从而介导NSCLC细胞对铂类药物的耐药性的表观遗传机制，该机制此前未被认识到。

图形摘要

研究方法与实验设计

细胞模型与药物处理：使用多种细胞模型，包括BEAS-2B（正常支气管上皮细胞）、KRAS野生型NSCLC细胞（NCI-H522）和KRAS突变型NSCLC细胞（NCI-H23）。通过过表达KRAS突变体（G12V）或敲低KRAS，研究其对铂类药物（顺铂）耐药性的影响。

m6A修饰分析：使用m6A-seq技术分析KRAS突变对mRNA

m6A修饰的影响。通过m6A免疫沉淀（MeRIP）和RT-qPCR验证特定基因（DDB2和XPC）的m6A修饰水平。

RNA-seq与基因表达分析：通过RNA-seq分析KRAS突变对基因表达的影响，并结合m6A-seq数据，寻找受KRAS突变影响的m6A修饰基因。

体内实验：通过NSCLC细胞的小鼠皮下移植瘤模型，验证KRAS突变对铂类药物耐药性的影响，并检测抑制m6A修饰（如METTL3抑制剂STM2457）是否能逆转耐药性。

关键结果图形

（1）KRAS突变与NSCLC铂类耐药相关

KRAS突变型NSCLC细胞对顺铂化疗药表现出显著的耐药性，表现为DNA损伤减少、细胞凋亡减少和克隆形成能力增强。KRAS突变通过激活ERK/JNK信号通路，抑制ALKBH5的去甲基化酶活性，导致m6A修饰水平整体性升高。

图1：KRAS组成性激活突变导致NSCLC对铂类药物的耐药性。

（2）KRAS突变体通过调控ALKBH5磷酸化和SUMO化来调节整体mRNA m6A甲基化

KRAS突变通过ERK/JNK信号通路诱导ALKBH5的磷酸化（Ser325）和SUMO化（Lys86和Lys321），抑制其去甲基化酶活性。这些修饰导致m6A修饰水平升高，特别是与核苷酸切除修复（NER）相关的基因（如DDB2和XPC）。

图2. KRAS组成性激活突变通过调节ALKBH5磷酸化和SUMO化调控整体mRNA
m6A甲基化。

（3）阻断ALKBH5 SUMO化可以抑制非小细胞肺癌细胞的铂耐药性。

图3：阻断ALKBH5-SUMO化抑制了NSCLC细胞的铂耐药性。

（4）转录组学（RNA-seq）和表观转录组学（m6A-seq）分析确定了核苷酸切除修复相关基因，包括DDB2和XPC，是KRAS突变体的关键下游靶基因。

研究者通过m6A-seq分析了KRAS野生型和KRAS G12V突变型细胞的m6A修饰图谱，发现KRAS突变显著改变了m6A修饰水平。并通过RNA-seq分析了KRAS野生型和KRAS G12V突变型细胞的基因表达谱，发现KRAS G12V过表达导致429个基因表达上调，283个基因表达下调。这些差异表达基因主要富集在RAS和MAPK信号通路、铂类耐药和DNA损伤修复相关通路中。

通过m6A-seq和RNA-seq的联合分析，研究者发现DDB2和XPC是KRAS突变的关键下游靶基因。这些基因的m6A修饰增加导致其表达上升，从而增强了NSCLC细胞的DNA损伤修复能力，促进了铂类化疗耐药。总之KRAS突变通过m6A修饰增加DDB2和XPC的mRNA稳定性，从而增强其表达。这些基因表达增加促进DNA损伤修复，使NSCLC细胞对铂类药物耐药。

图4. RNA-seq和m6A-seq鉴定出DDB2和XPC是KRAS突变的关键下游靶基因。

A. 火山图显示KRAS G12V过表达在NCI-H522细胞中诱导的差异表达基因。

B. GO分析KRAS G12V过表达诱导的差异表达基因。

C. GSEA图显示在KRAS G12V过表达的NCI-H522细胞中，DNA损伤修复和KRAS信号通路相关基因集的富集情况。

D. 热图显示图4C中KRAS G12V过表达诱导的DNA损伤修复相关基因的上调基因列表。

E. 基因分布图显示通过m6A-seq鉴定的基因，这些基因在mRNA的m6A甲基化和整体表达方面因KRAS G12V过表达而发生显著变化。

F. 维恩图显示在KRAS G12V过表达时，既有显著表达变化又有m6A修饰变化的重叠基因。

G. 通过RNA-seq和m6A-seq数据的综合分析，GO分析在NCI-H522细胞中鉴定出KRAS
G12V以m6A依赖性方式调控的下游靶基因。

H-I. RNA-seq和m6A-seq峰值可视化：显示对照组和KRAS G12V过表达的NCI-H522细胞中DDB2和XPC转录本的RNA-seq和m6A-seq峰值。

J-K. RT-qPCR分析表明KRAS G12V过表达介导DDB2和XPC上调可通过敲低METTL3挽救。

L-M. MeRIP分析表明KRAS G12V过表达诱导的DDB2和XPC转录本的m6A甲基化水平上调可被METTL3缺失赖抑制。

（5）顺铂/KRAS诱导DDB2和XPC的m6A修饰导致其mRNA稳定

图5：顺铂/KRAS诱导DDB2和XPC的m6A修饰导致其mRNA稳定。

（6）体内实验验证

在裸鼠移植瘤模型中，KRAS突变型NSCLC细胞对顺铂耐药，而过表达SUMO化缺陷型ALKBH5或抑制METTL3可以逆转耐药性。这些结果表明，抑制m6A修饰可以增强KRAS突变型NSCLC细胞对铂类药物的敏感性。

图6：KRAS突变体通过在体内调控AKBH5-PTMs介导的DNA修复通路导致NSCLC耐药性

图7：METTL3抑制使携带KRAS突变的NSCLC细胞在体内对顺铂敏感。

图8：KRAS/ERK/JNK/ALKBH5-PTMs/m6A/DDB2&XPC/核苷酸切除修复信号轴在临床肺癌患者中频繁发生

易小结

本研究通过m6A-seq和对应的RNA-seq揭示了KRAS突变通过激活ERK/JNK信号通路调控ALKBH5的PTMs，进而影响m6A修饰水平，最终通过稳定DDB2和XPC的mRNA，增强DNA损伤修复能力，导致铂类化疗耐药。通过抑制METTL3或过表达SUMO化缺失型ALKBH5可以逆转KRAS突变型NSCLC的铂类耐药性。这为KRAS突变型NSCLC的治疗提供了新靶点和策略。

本研究结果揭示了KRAS突变在NSCLC化疗耐药中的分子机制，为开发新的联合治疗方案提供了理论依据。通过抑制m6A修饰，可能为KRAS突变型NSCLC患者提供更有效的治疗选择。

m6A-seq和RNA-seq在本研究中的重要作用

m6A-seq为本研究提供了m6A修饰的全转录组图谱，揭示了KRAS突变如何通过m6A修饰调控基因表达，尤其是与DNA损伤修复相关的基因（如DDB2和XPC）。

RNA-seq为本研究提供了基因表达的全转录组图谱，揭示了KRAS突变对基因表达的影响，并与m6A-seq结果相结合，进一步证实了m6A修饰对基因表达的调控作用。

两者的联合分析为研究KRAS突变在NSCLC化疗耐药中的分子机制提供了全面的视角，并为开发新的治疗策略提供了重要的靶点（如METTL3和DDB2/XPC）。

通过这两种技术，研究者不仅揭示了KRAS突变的下游效应，还为理解m6A修饰在癌症中的作用提供了新的理论依据。

参考文献：

Yu F, Zheng S, Yu C,Gao S, Shen Z, Nar R, Liu Z, Huang S, Wu L, Gu T, Qian Z. KRAS Mutants Confer PlatinumResistance by Regulating ALKBH5 Post-translational Modifications in LungCancer. J Clin Invest. 2025 Feb 4. pii: 185149. doi: 10.1172/JCI185149. PubMedPMID: 39960727.