为什么要做HIC三维基因组测序？（原理）
解密基因如何折叠与调控，Hi-C技术成为了探索基因组三维结构与功能的重要工具。那为什么我们要做Hi-C三维基因组研究？它到底能为我们带来哪些新发现？本文将为大家解答这些疑问。
基因组不是“平面图”，而是“立体图”
传统的基因组学研究大多关注基因序列的线性排列，但实际上，基因组在细胞中的结构并非简单的线性排列，它是一个复杂的三维结构。在三维空间中，基因并非孤立存在，而是互相交织、相互影响。Hi-C技术通过捕捉基因组中不同区域之间的物理接触信息，帮助我们描绘出基因组的三维“地图”，揭示基因组折叠的奥秘。
揭示基因调控的秘密
基因并不是孤立地表达，而是受到多种因素的调控。通过Hi-C技术，我们能够更好地理解基因与基因之间、基因与调控元件之间的相互作用。这些相互作用对于细胞功能、发育过程以及疾病的发生都至关重要。举个例子，癌症、糖尿病等疾病的发生往往与基因调控的异常密切相关，Hi-C技术为研究者提供了更为直观的工具来探索这些异常的发生机制。
Hierarchical chromatin structure
如何研究3D基因组
- 显微镜＋原位杂交（FISH）
- 高通量测序（交联、不交联）
HIC原理
稀释 Hi-C
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甲醛交联：首先使用甲醛将活细胞或组织中的染色质结构固定，锁定染色质在核内的空间位置。这一步骤是为了捕捉染色质纤维之间的物理接触点。
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酶切打断：使用限制性内切酶（如HindIII、EcoRI等）切割固定的染色质。酶的选择取决于想要达到的分辨率和后续步骤的要求。
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末端修复：将酶切后的DNA末端进行修复，使其成为平滑的双链末端，方便后续接头的连接。
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添加生物素标记：在修复的DNA末端接上含生物素的核苷酸。生物素标记使得后续可以通过亲和纯化的方法特异性地捕获这些DNA片段。
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近端连接：将交联的DNA片段在体内进行连接。这一步骤使得原本在三维空间中相邻的但在一维DNA序列中不相邻的DNA片段被连接起来。
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纯化和筛选DNA：去除交联剂，纯化DNA，并通过亲和层析法（如使用磁珠）选择性地富集带有生物素标记的DNA片段。
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双未端测序：利用高通量测序技术对富集后的DNA片段进行双端测序。这一步骤生成大量的读段，这些读段包含了原始染色质交互作用的信息。
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数据分析：通过生信方法，识别染色质间的相互作用区域，构建染色质的三维结构模型。
细胞裂解，高度稀释后进行连接
问题：随机连接，自连
in situ （原位） Hi-C
在细胞核内进行近端连接，大大减少了随机连接。
问题：消化不完全。空间狭小，导致假连接。
酶的升级
以下是提取的文字内容：
| 酶切酶 | 识别序列 | 切割频率 | 优点 | 缺点 | 参考文献 |
|---|---|---|---|---|---|
| HindIII | A^AGCTT | 中等（约4kb） | 常用的经典酶，数据丰富 | 中等分辨率，限制性位点间距可能影响结果 | Lieberman-Aiden et al., 2009 |
| MboI | ^GATC | 高频（约1kb） | 高频率，适合捕捉细致结构 | 可能产生较多背景噪音 | Rao et al., 2014 |
| DpnII | ^GATC | 高频（约1kb） | 高频率，适合小片段 | 可能产生较多背景噪音 | Bonev et al., 2017 |
| NcoI | C^CATGG | 低频（约6kb） | 适合大范围染色质结构研究 | 分辨率较低 | Sexton et al., 2012 |
| EcoRI | G^AATTC | 中等（约4kb） | 广泛使用的数据 | 分辨率中等 | Jin et al., 2013 |
| BglII | A^GATCT | 中等（约4kb） | 分辨率适中，数据广泛 | 切割频率中等 | Dixon et al., 2012 |
识别序列从6碱基升级到4碱基，提升了分辨率。
HiChIP&HiCUT
HiChIP
结合了Hi-C技术和免疫沉淀，能够在全基因组范围内捕获和分析染色质的三维结构。
在HiChIP中，长距离的DNA接触首先在细胞核内建立，然后再进行细胞裂解，这样可以最小化可能的假阳性相互作用，并大大提高DNA接触捕获的效率。接着，进行ChIP，直接捕获与感兴趣的蛋白质相关的长距离相互作用。随后，成对末端测序可以从一个片段中识别出基因组中两个远距离的片段，表明感兴趣的因子与长距离相互作用相关。
HiCUT
Hi-C技术与CUT&TAG结合
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