全基因合成

1：根据客户序列设计拼接引物。最下面的是个例子。

2：引物合成仪合成引物。

3：PCR拼接。

引物合成部合成10OD引物大约在5 nmol左右。加400uL -500uL TE 溶解，引物浓度是10pmol左右。

根据基因长度分段扩增，一段大概在14-18条引物之间举例：

1   1-16  

 2   15-32

  3  31-46

  4   45-60

预扩：每条引物吸5 uL，14-16条引物混合吸5uL混合物做模板。

首尾引物各加1uL (也可选择不加，在混合引物时首尾引物多加10uL)

PCR总管（pfu酶，DNTP ,buffer）

最终加水补足总50uL的反应体系

PCR扩增,点胶回收,对比DNAmark看扩增片段是否与目的片段一致，PCR产物互相之间也可以做为参考（正确判断扩增产物的大小，亮度，单一性很重要）,当点胶回收的片段都正确，如需扩增更大的片段，则继续重叠延伸PCR，直至把全长片段扩出来。每一轮的重叠延伸PCR都要点胶回收看片段大小

4 PCR产物克隆连接载体。（平末端连接，同源连接，酶切连接），根据方案选择。

5  转化：（具体实验步骤网上有很多）

6  平板过夜长好后，挑斑鉴定阳性克隆（菌捡）菌捡的具体步骤，网上或者公司说明书上都有。

7. 阳性克隆接菌 提质粒，测序。

8.测序结果与目的序列比对，看有没有错误，没有错误的说明做对了。没有完全正确的克隆的话根据实际情况，加测，或者修复。扩增一个正确的PCR产物再返回第4步实验。重复一次。直到挑到正确的克隆！

大概的实验步骤就这些！

武汉百沃克生物科技有限公司自成立以来，始终秉持着创新驱动发展的理念，积极投入到生物科技领域的前沿探索中。凭借专业的技术团队和先进的研发设备，在生物基材料、分子检测、基因合成等多个核心业务板块不断深耕，致力于为客户提供高品质、定制化的生物技术解决方案。公司注重与国内外科研机构及企业的合作交流，积极引进先进技术和理念，推动自身技术水平的持续提升，以更好地满足市场需求，为生物科技行业的发展贡献力量 。