新品赋能全预混试剂的全速开发：温启动逆转录酶——快速精准，持久稳定
随着冬季来临，季节性流感、肺炎等呼吸道疾病高发，多地医院出现了就诊高峰，及时为患者提供有效的治疗，快速准确的诊断方法显得尤为重要。在众多检测方法和检测试剂中，一步 RT-qPCR 法（一管式 RNA 全预混试剂）因其高效、便捷、灵敏等优势，受到了广泛青睐。
在一步法反应中，理论上是基因特异性引物首先与待检测靶标匹配，并在逆转录酶的催化下合成第一链 cDNA，然而在实际应用中，经常会出现错误的模板-引物匹配产生的非特异 cDNA。非特异性 cDNA 会使体系内部出现非特异性扩增，并消耗反应所需组分，限制后续主反应进行，当靶核酸的浓度较低时，会因为竞争作用而使得扩增性能变差，如扩增曲线形态差、荧光增量低、Ct 值滞后等，从而大大降低检测试剂的灵敏度和特异性。
另外，由于一管式 RNA 全预混试剂是将酶液和引物探针以及反应液提前预混在一管，在长期保存过程中，酶液活力很容易下降或者直接失活，从而导致全预混试剂性能出现问题。
逆转录（RT）酶，作为其关键成分，其性能将直接影响一步法核酸检测试剂的准确性和灵敏度，提高逆转录酶的特异性和稳定性对一管式 RNA 全预混试剂的开发至关重要。
基于此，瀚海新酶针对一步法 RT-qPCR/PCR 场景和一管式 RNA 全预混试剂开发了一款温启动逆转录酶，其在低温下，酶活被封闭并在工作温度下激活，避免了低温下的引物-模板错误匹配和逆转，提高了检测特异性和灵敏度。该款逆转录酶是采用适配体的方法进行的热启动修饰，瀚海新酶利用适配体筛选平台，制备了庞大的寡核苷酸随机序列文库，并在传统 SELEX 适配体筛选技术的基础上进行优化改进，利用高通量测序替代传统的克隆测序，经过多轮筛选和富集，选取了逆转录酶亲和力高的适配体，再将这些亲和力高的序列与逆转录酶进行孵育混合，然后测试低温和工作温度下不同适配体修饰酶的酶活，从而确定封闭和激活效果较优的适配体，同时对适配体进行组合筛选和对酶修饰工艺进行优化。最终瀚海新酶经过大量筛选和酶修饰工艺优化，开发的温启动逆转录酶在 42℃ 下可封闭 99% 的酶活，相比于市面同类竞品在低温下的封闭效果更好，封闭稳定性更强，使反应液能长期持续稳定高效地获得逆转录产物，解决了全预混试剂储存稳定性的难题。同时，该产品在工作温度（55℃）下，即可释放 95% 以上的酶活，保证了试剂的扩增灵敏度。
优越的产品性能
全封闭
在进⾏适配体修饰封闭之后，瀚海新酶温启动逆转录酶在非工作温度 30℃/ 37℃ / 42℃下酶活性极低，封闭效率显著优于竞品 A，这对控制非特异性扩增更有利，而在工作温度下（55℃），活性即可完全释放，对扩增性能无任何影响。（图2）
高灵敏
得益于温启动特性，瀚海新酶温启动逆转录酶能够保证在低浓度模板情况下，仍能扩增特异性靶标，扩增平台期与高拷贝数模板一致（图 3A），且瀚海新酶整套温启动逆转录酶产品和同类竞品 A 相比，分别在 3 个不同体系里进行测试，瀚海新酶产品无论从 Ct 值出峰时间还是检出率来看，其性能均优于竞品 A（图 3B）。
超快速
瀚海新酶温启动逆转录酶经过改造，能够以更快的速率合成 cDNA，在 PCR 程序一致的情况下，2 min 逆转录可达到和 15 min 逆转录同样的灵敏度。
长稳定
在某两个RNA 项目一管式液体全预混反应液（RNA 全预混，反应液、酶液、引物探针提前预混在一管）中，经37℃ 加压 7 天，瀚海新酶温启动逆转录酶性能不受影响，而竞品 A 经 37℃ 加压 7 天后，扩增性能严重落后，灵敏度延后超 2 个Ct。
应用案例分享
瀚海新酶温启动逆转录酶帮助客户优化和解决了不同问题，尤其是在 RNA 全预混稳定性中的应用最为突出，具体案例应用效果分享如下。
相比于市面同类温启动逆转录酶，瀚海新酶温启动逆转录酶可在更高温度下封闭酶活，封闭效率更高、封闭稳定性更强，可防止引物探针等关键成分的降解，在确保高灵敏和兼容快速程序的前提下，赋予全预混试剂更高稳定性。
将瀚海新酶温启动逆转录酶和同类竞品 A 分别应用于 RNA 全预混试剂中（反应液、酶液、多重引物探针提前预混在一管），经 37℃ 加压 10天处理，新配制的全预混试剂作对照，在 30min 快速程序下测试。结果显示：使用瀚海新酶温启动逆转录酶配制的全预混试剂在加压处理条件下与新配制的对照组无显著差异，而使用竞品 A 配制的全预混试剂在加压处理后，扩增效率明显降低（Ct 值靠后，荧光平台期下降）。
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