WB试剂与耗材选择指南

一、蛋白裂解试剂：从样本到溶液的核心

1. 裂解液选择
   1. RIPA缓冲液：通用型裂解液（适合胞浆/膜蛋白），但可能破坏蛋白互作，需根据实验目的调整pH（7.4-8.6）。
   2. NP-40/Triton X-100：温和裂解液，保留蛋白活性，适用于免疫共沉淀（Co-IP）。
   3. 含SDS裂解液：强变性能力，适合难溶蛋白（如核蛋白），但需注意后续实验兼容性（如避免干扰BCA定量）。
2. 蛋白酶抑制剂
   1. 常规实验选“鸡尾酒”复合抑制剂（抑制丝氨酸、半胱氨酸等蛋白酶），磷酸化研究需添加磷酸酶抑制剂（如NaF、β-甘油磷酸钠）。
      

二、电泳耗材：分离蛋白的隐形推手

1. 凝胶配方
   1. 分离胶浓度：按目标蛋白分子量选择（8%-15%），低浓度胶（8%）适合大分子量（＞150 kDa），高浓度（12%）适配小蛋白（＜50 kDa）。
   2. APS与TEMED：确保新鲜配制（APS溶液保存≤1周），凝固时间控制在30分钟内，避免过度交联导致孔径不均。
2. 电泳缓冲液
   1. Tris-Glycine体系（pH 8.3）为通用选择，若跑小分子蛋白（＜15 kDa）可改用Tris-Tricine缓冲液（减少蛋白扩散）。

三、转膜材料：信号传递的关键载体

1. 转膜膜材
   1. 硝酸纤维素膜（NC膜）：高蛋白结合力（80-100 μg/cm²），成本低，但脆性大，易破裂。
   2. PVDF膜：机械强度高，兼容多次剥离，需甲醇预激活（10秒）以增强疏水性。
2. 转膜缓冲液
   1. 湿转法用Tris-Glycine-甲醇体系（含20%甲醇增强蛋白吸附），半干转用不含甲醇的Tris-CAPS缓冲液（减少小蛋白损失）。

四、抗体与封闭剂：信号特异性的守护者

1. 封闭剂选择
   1. 5%脱脂牛奶：经济通用，但含磷酸酶干扰物，不适用于磷酸化蛋白检测。
   2. 5% BSA：适合磷酸化抗体封闭，避免酪蛋白干扰，成本较高。
2. 一抗/二抗优化
   1. 一抗宿主：检测小鼠样本时选择兔/羊源一抗，避免种属交叉反应。
   2. 二抗标记：HRP标记适配ECL化学发光，荧光标记（如Cy3、FITC）需匹配成像仪波长。

五、显影试剂：信号的放大器

1. ECL化学发光液
   1. 常规检测选普通型（信号持续10-30分钟），弱信号用增强型（信号延长至2小时）。
   2. 避光保存，现用现配（A/B液按1:1混合），避免反复冻融。
2. 荧光二抗配套试剂
   1. 抗淬灭封片剂（含DAPI可同步核染色），需避光保存防止荧光衰减。

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