WB检测关键截点解析

一、样品制备：从源头把控质量

1. 蛋白裂解效率
   1. 判断依据：裂解后液体应澄清无沉淀，离心后沉淀量＜5%。
   2. 问题解决：若沉淀过多，需增加裂解液浓度（如RIPA+1% SDS）或延长超声时间。
2. 蛋白定量准确性
   1. 关键操作：使用BCA法或Bradford法，OD值需在标准曲线线性范围内（建议稀释样本至0.2-2 mg/mL）。
   2. 避坑提示：避免高浓度SDS或DTT干扰，可透析或稀释后检测。

二、电泳分离：条带形态决定成败

1. 凝胶浓度选择
   1. 低分子量蛋白（＜30 kDa）选12%-15%分离胶；大分子（＞100 kDa）用8%-10%胶。
   2. 异常条带：若出现“微笑条带”（边缘扩散），可能电压过高（建议恒压80-100 V）。
2. Marker对照
   1. 预染Marker应清晰分层，若条带模糊或断裂，需更换新鲜电泳缓冲液（Tris-Glycine pH 8.3）。

三、转膜效率：信号强度的隐形门槛

1. 转膜验证
   1. 湿转法（＞50 kDa蛋白）用250 mA 90分钟；半干转（小蛋白）25 V 7分钟。
   2. 检测方法：转膜后用丽春红染色观察，若Marker未完全转移需延长转膜时间。
2. 膜的选择
   1. PVDF膜需甲醇激活（10秒），硝酸纤维素膜（NC膜）直接使用，避免触碰导致膜破损。

四、封闭与抗体孵育：降低背景的关键

1. 封闭充分性
   1. 5%脱脂牛奶（磷酸化蛋白用BSA）封闭1小时，若背景高可延长至2小时或提高浓度至7%。
2. 一抗稀释优化
   1. 初试建议1:500-1:2000稀释，阳性对照无信号时优先调整一抗浓度而非直接更换抗体。
3. 二抗交叉污染
   1. 不同宿主来源的一抗需使用对应二抗（如兔源一抗+HRP标记抗兔二抗），孵育后严格洗膜3×10分钟。

五、显影与信号分析：数据的终极判读

1. 曝光时间控制
   1. ECL化学发光法先试短曝光（10秒），避免过曝；弱信号可累计曝光至5分钟。
2. 条带异常解析
   1. 无信号：检查抗体效期、二抗是否失活（可用β-actin复检）；
   2. 非特异性条带：增加封闭时间或添加1% Triton X-100洗膜。

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