RBP研究技术RIP-seq+Polysome profiling

【RNA结合蛋白ARID5A驱动IL-17依赖性自身抗体诱导的肾小球肾炎】

自身抗体介导的肾小球肾炎（AGN）是由肾脏炎症失调引起的重大健康问题，尽管现有的治疗方法可以提高生存率，但效果有限，而且副作用严重。因此，迫切需要改进的治疗方法。IL-17在AGN中的作用已被广泛研究，但其下游的分子信号以及调控机制仍不清楚。最近研究发现，RNA结合蛋白ARID5A(AT-rich interactive domain-containing protein 5a)在AGN中显著上调，并在IL-17依赖性肾脏炎症中发挥关键作用。

文章题目：The RNA binding protein Arid5adrives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis

发表期刊：Journal Of Experimental Medicine

科研团队：美国匹兹堡大学医学系、免疫学系等

发表时间：2024年7月26日

主要发现

1. ARID5A在AGN中起关键作用：ARID5A通过调控IL-17依赖性炎症反应，驱动AGN的病理过程。

2. ARID5A的翻译调控功能：ARID5A通过与核糖体相互作用，增强关键炎症转录因子（如C/EBPs）的翻译，从而促进AGN的发展。

研究意义

该研究揭示了ARID5A在IL-17依赖性肾脏炎症中的重要作用，为开发针对AGN的新型治疗策略提供了潜在靶点。通过选择性抑制ARID5A，可能在不影响宿主防御的情况下，有效控制自身免疫性肾脏疾病。

研究结果

1.ARID5A在人类和小鼠AGN中表达升高

ARID5A在人组织中的表达：分析欧洲肾脏cDNA数据库（European Renal cDNA Bank）发现IL17RA mRNA在多种AGN中表达升高。类似地ARID5A mRNA也在多种AGN（如IgA肾病、ANCA相关性肾炎等）中显著上调。采用RNAScope原位杂交对肾组织进行活检，结果表明在ANCA-GN患者中ARID5A的表达也显著升高。

ARID5A在小鼠中的表达：在Act1缺失小鼠（Act1−/−）的肾组织中ARID5A的诱导减弱，以及IL-17特征减少，因此ARID5A的诱导依赖于IL-17信号通路。与ANCA-GN患者类似，在AGN期间的肾小管上皮细胞（RTECs）中ARID5A的表达显著上调。因此，ARID5A主要在AGN期间的IL-17应答性肾脏细胞中高表达。

图1. AGN期间ARID5A在人和小鼠肾上皮中表达升高。

2.ARID5A能够增强AGN病理

肾功能保护：ARID5A缺失的小鼠诱导AGN后，肾功能指标（如血尿素氮BUN和肌酐）显著低于野生型小鼠，表明ARID5A缺失能够保护肾脏免受AGN的损害。

炎症反应减弱：ARID5A缺失小鼠的肾脏中，IL-17依赖性炎症因子（如IL-6、Lcn2、Ccl2等）的表达显著降低，且髓系细胞（如单核细胞和巨噬细胞）的浸润也明显减少。

组织病理学改善：ARID5A缺失小鼠的肾脏组织病理学评分显著改善，异常肾小球的数量减少，表明ARID5A在AGN的病理过程中起关键作用。

图2. ARID5A对于AGN是必需的。

3.ARID5A调控C/EBP转录因子的蛋白积累

C/EBP转录因子的表达：在AGN模型中，C/EBPβ和C/EBPδ的mRNA水平在ARID5A缺失小鼠中并未显著变化，但其蛋白水平显著降低。这表明ARID5A主要通过调控C/EBP转录因子的翻译而非转录来影响其表达。

IL-17诱导的C/EBP蛋白积累：在体外实验中，IL-17刺激后，ARID5A缺失的RTECs中C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平显著降低，进一步证实了ARID5A在IL-17依赖性C/EBP蛋白积累中的关键作用。

图3. ARID5A调控C/EBP转录因子。

4.ARID5A结合的RNA靶点鉴定

RIP-Seq分析：通过RNA免疫沉淀测序（RIP-Seq），研究人员发现ARID5A在IL-17刺激后与多种RNA结合，其中包括炎症相关mRNA（如CEBPD、NFKBIZ）以及核糖体RNA（rRNA）和翻译相关RNA。

图4. 鉴定RTECs中ARID5A靶标转录本。

5.ARID5A与核糖体相互作用，促进蛋白质翻译

ARID5A与核糖体的相互作用：嘌呤霉素掺入实验表明ARID5A以某种方式促进翻译。通过蔗糖梯度离心（Polysome profiling）和免疫印迹分析，研究人员发现ARID5A主要与40S核糖体亚基结合，而在60S和80S核糖体中的结合较弱，表明ARID5A可能在翻译起始阶段发挥作用。荧光共聚焦成像显示IL-17依赖的ARID5A与核糖体共定位。此外，IL-17促进ARID5A从细胞核输出到细胞质，并与40S核糖体亚基（18S rRNA）结合。ARID5A还与60S核糖体亚基（5S rRNA）有较弱的相互作用，表明ARID5A可能在翻译起始过程中发挥动态作用。

全局翻译调控：ARID5A缺失的细胞中，全局蛋白质合成显著减少，表明ARID5A在维持细胞翻译活性中起重要作用。

炎症因子的翻译增强：IL-17刺激后，ARID5A通过与核糖体结合，增强了C/EBPδ和IL-6等炎症因子的翻译效率，从而促进了AGN的病理过程。

图5. Arid5a促进RTECs中的蛋白质合成。

ARID5A功能在ST2细胞中的验证：在IL-17敏感的ST2细胞中，ARID5A同样表现出与核糖体的相互作用，并调控炎症因子的翻译。RIP-Seq分析显示，ARID5A在ST2细胞中结合的RNA靶点与HK-2细胞中的结果高度一致，进一步验证了ARID5A在IL-17信号通路中的保守功能。

图6. Arid5a结合rRNA，促进小鼠基质细胞中的蛋白质合成。

ARID5A在AGN中的病理机制模型：IL-17刺激后，ARID5A从细胞核输出到细胞质，与40S核糖体亚基结合，增强C/EBPδ和IL-6等炎症因子的翻译效率。这些炎症因子进一步促进肾脏炎症和AGN的病理过程。

图7. Arid5a的作用模型。

研究小结

这项研究揭示了ARID5A在IL-17依赖性肾脏炎症中的关键作用，特别是通过调控C/EBP转录因子的翻译来驱动AGN的病理过程。ARID5A的发现为开发针对AGN的新型治疗策略提供了潜在靶点，尤其是通过选择性抑制ARID5A来阻断IL-17信号通路，可能在不影响宿主防御的情况下有效控制自身免疫性肾脏疾病。

参考文献

YangLi, Shachi P Vyas, Isha Mehta, et al. (2024). The RNA binding protein Arid5adrives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis. Journal ofExperimental Medicine, 221(9), e20240656.

RBP研究方案设计：RIP-seq + Polysome profiling

1. 研究背景

RNA结合蛋白（RBP）在转录后调控中起关键作用，影响RNA的稳定性、定位、翻译和降解。RIP-seq（RNA免疫共沉淀测序）和Polysome Profiling（多核糖体分析）联合使用，可全面研究RBP与RNA的相互作用及其对翻译的影响。

2. 研究目标

1) 鉴定特定RBP结合的RNA分子。

2) 分析RBP对RNA翻译效率的影响。

3) 探索RBP在转录后调控中的机制。

3. 实验设计

3.1 实验材料

1) 细胞系：选择目标RBP高表达的细胞。

2) 抗体：针对目标RBP的特异性抗体。

3.2 实验步骤

3.2.1 细胞培养与处理

1) 培养目标细胞至对数生长期。

2) 根据实验需求处理细胞（如药物处理、基因敲除/过表达等）。

3.2.2 RNA免疫共沉淀（RIP）

1) 细胞裂解：收集细胞，使用裂解缓冲液裂解。

2) 免疫沉淀：加入RBP特异性抗体，孵育后与蛋白A/G磁珠结合，捕获RBP-RNA复合物。

3) 洗涤：洗涤磁珠，去除非特异性结合。

4) RNA提取：解离RBP-RNA复合物，提取RNA。

3.2.3 Polysome Profiling

1) 细胞裂解：收集细胞，使用裂解缓冲液裂解。

2) 蔗糖梯度离心：制备蔗糖梯度，超速离心分离多核糖体。

3) 分部收集：收集不同密度的多核糖体组分。

4) RNA提取：从各组分中提取RNA。

3.2.4 RNA-seq

1) RNA质量检测：检测RNA质量。

2) 建库：使用RNA-seq建库试剂盒构建测序文库。

3) 测序：进行高通量测序（如Illumina平台）。

3.2.5 数据分析

1) 数据预处理：去除低质量reads和接头序列。

2) 比对：将reads比对到参考基因组。

3) 差异表达分析：比较RIP-seq和Polysome Profiling数据，识别RBP结合的RNA及其翻译效率变化。

4) 功能注释：对差异表达的RNA进行GO和KEGG通路分析。

4. 预期结果

1) 鉴定出RBP结合的靶RNA。

2) 分析RBP对RNA翻译效率的影响。

3) 揭示RBP在转录后调控中的潜在机制。

5. 研究意义

1) 全面解析RBP的功能及其对RNA翻译的调控机制。

2) 提供RBP在转录后调控中的新见解。

3) 为相关疾病机制研究和治疗靶点开发提供依据。