qPCR引物如何设计？

qPCR引物设计的一般原则与基因克隆引物相同，也需要满足：GC含量在40%-60%之间，Tm值在55-65℃，一对引物Tm值、GC含量不能相差太大，长度在16-30 bp为宜，避免引物发生互补，碱基要随机分布等条件，但要注意：

1.qPCR引物的扩增产物通常控制在100-200bp左右；

2.qPCR引物主要用于反映目的基因的表达量状况，所以引物序列只包括与目标基因互补配对的序列；

3.若qPCR采用探针法进行，引物对需分别设置在探针结合序列的上下游；

4.若qPCR采用染料法进行，引物对的靶点尽量设在CDS序列3’端。

qPCR引物的设计通常是由引物设计软件辅助完成，利用NCBI-Primer-BLAST设计STAT3基因的定量引物，共给出10对满足要求的引物，主要分布在STAT3序列的5’端和3’端，如何选择引物对更能保证实验的准确性？

答案是：推荐选择靠近3’端的引物对。这是因为qPCR实验的底物cDNA是mRNA经过逆转录合成的，逆转录酶合成cDNA的过程是从cDNA的5’ 端开始向3’端方向合成，换言之，对于mRNA来说，逆转录酶是沿着它的3’端向5’端前进的。但mRNA具有复杂的二级结构甚至三级结构，对于较长的转录本，逆转录酶的合成过程可能会受阻或停止，所以优势cDNA产物往往会富集在靠近mRNA3’端位置，因此较长的转录本选择3’端引物，获得的实验结果相对更稳定可靠。