基因功能研究思路

基本要求

科研思路：参考孟德尔《植物杂交实验》

发现问题——提出假设——实验验证——得出结果——分析结果——升华

文章思路也是如此

注意事项：

最基本的过表达，敲除或干扰实验

体外实验（In vitro）快速，但一般需要体内实验（In vivo）来验证

孤证不立，一般要多方面验证

基因网络，上下游作用与调控

相关性并非因果关系

研究思路

正向遗传学：表型——>基因

反向遗传学：基因——>表型

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涉及到的实验技术:

A1-A3: EMS诱变、辐射诱变、自然突变或其他方式获得差异性状材料，一般不知道突变在哪里，需要极辛苦地去鉴定。

A4-A5: T-DNA插入突变体库、激活标签突变体库，不知道突变在哪里，但可以轻松鉴定。现在有些实验室已经创制了基因编辑突变体库，它相比标签突变体库的优点是，能够更直接的知道突变基因的位置和突变情况。

B1: 由A1-A3获得基因的方法: 图位克隆、混合分组分析 (BSA)全基因组关联分析 (GWAS)。

B2: 因为标签序列是已知的，所以可以根据这些标签序列通过TAIL PCR的方法找到插入位点，就可以很快的知道哪个基因被插入或激活。

B3: 通过转录组/蛋白组/代谢组差异表达分析获得的基因，通过蛋白-核酸相互作用实验、蛋白-蛋白相互作用实验，根据已研究过的基因的同源性找到的基因，这些基因是先知道序列但是不知道其对应的性状/功能，所以需要通过功能验证进行进一步的分析

B:一般在获得候选基因的序列后，会在本物种中对同源基因进行序列比对，以及在不同物种中对该基因及其同源基因甚至蛋白序列进行序列比对、进化关系分析等。此外，还会进行相关文献搜索数据库搜索、组织表达检测等。

C1: 克隆模板: 一般是DNA，少数情况会选择以基因组为模板。

C2: 克隆模板: 基因组。

C3: 克隆模板: 基因组，这里的非编码序列是指miRNA、IncRNA、circRNA。

注: C中如果不知道完整的基因组序列可用DNA walking技术，如果不知道完整的CDS序列，可试试3’RACE、5RACE技术

D1: 构建载体：按载体功能分类，构建过表达载体/互补载体、发夹干扰载体、ammiRNA载体、基因编辑载体等；按启动子功能分类，除了常用的组成型表达载体，也会根据实验目的构建诱导型启动子、组织特异性启动子载体。

D2：构建启动子分析载体：研究基因的时空表达，即目的基因的启动子+报告基因；启动子截短实验/启动子活性分析/启动子和转录因子是否相互作用: 使用双荧光素酶报告基因系统检测。

D3：构建载体: 过表达miRNA/IncRNA/circRNA前体、构建STTM载体以干扰miRNA。

注：D中所涉及的载体构建技术: 传统的双酶切-连接-转化、Gateway克隆技术、Golden Gate克隆技术、Gibson同源重组技术，现在一般使用后两种构建技术。

E: 植物转基因技术，一般使用农杆菌介导的遗传转化体系，优点是效率高、T-DNA整合效果好、拷贝数低。瞬时干扰技术：VIGS。

F:对转基因植株的检测：

1、确定转基因阳性植株: PCR (由于实验室气溶胶污染易出现假阳性，建立标准PCR实验室可避免出现这种情况)，也可以使用试纸条快速鉴定真核抗性蛋白；

2、荧光定量PCR (qRT-PCR) ，检测基因的相对表达量即mRNA的相对表达量的，用来分析基因表达丰度和性状之间的相关性。注意qRT-PCR还可以用于检测miRNA/lncRNA、拷贝数鉴定、绝对定量等；

3、Western blot，用来分析蛋白表达量及其与性状之间的相关性；

4、TAIL PCR技术分析转基因插入位点在基因组的位置，基于二代测序技术分析转基因插入位点；

5、Southern blot技术用于分析转基因拷贝数 (也可以使用qRT-PCR进行确定，但Southern是金标准)；

6、其他检测:表型检测、生理生化实验等。

G：蛋白实验：

G1:亚细胞定位实验: 先通过生物信息学预测基因的定位区域，然后通过与Marker蛋白共定位确定其亚细胞定位的位置

G2: 体外表达纯化，可以用大肠杆菌或酵母，然后通过蛋白标签进行亲和纯化，纯化到目标蛋白后可以做一些体外活性实验，如果是一个酶可以做催化活性验证，如果是转录因子可以进一步分析其识别的DNA元件，如果是信号蛋白可以进一步分析其相互作用蛋白。

G3：筛选蛋白-蛋白相互作用: 酵母双杂筛库、IP-MS、Pull down-MS等；

验证蛋白-蛋白相互作用: 酵母双杂、Co-IP、GST Pull-down、 BiFC、荧光素酶蛋白互作分析等。

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G4：筛选蛋白-核酸相互作用: 酵母单杂筛库 (用启动子筛选转录因子)、ChIP-seq (用转录因子找启动子)、DNA/RNA Pull-down、RIP等；

验证蛋白-核酸相互作用: 酵母单杂、EMSA、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因系统、DNA/RNA Pull down、 RIP等。

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以上互作筛出来之后，一定要做点对点的验证实验（孤证不立）

H: 可将上述实验结果再结合转录组、蛋白组、代谢组等数据一起分析，这些结果原则上具有一致性和统一性，能够相互解释和印证。由蛋白实验筛选出的相互作用蛋白、核酸等可重复以上研究路线，通过表型或检测数据更进一步将信号通路范围拓宽，最终推断出信号通路图。

案例

3分文章反向遗传学方法：BEAR1, a bHLH Transcription Factor, Controls Salt Response Genes to Regulate Rice Salt Response. February 2022Journal of Plant Biology 65(5)

5分文章正向遗传学方法：Cheng M, Meng F, Mo F, et al. Slym1 control the color etiolation of leaves by facilitating the decomposition of chlorophyll in tomato. Plant Sci. 2022;324:111457.

12分文章反向遗传学方法：Xu X, Zhang Q, Gao X, et al. Auxin and abscisic acid antagonistically regulate ascorbic acid production via the SlMAPK8-SlARF4-SlMYB11 module in tomato. Plant Cell. 2022;34(11):4409-4427.

文章图片规划

• 突变体表型图/图位克隆/BSA-seq/GWAS

• 进化关系

• 过表达/基因编辑/RNAi/VIGS、生理生化

• 亚细胞定位

• 酵母双杂、Co-lP、BiFC、Pull-down、双荧光素酶互作实验

• 酵母单杂、EMSA、ChIP-seq、双荧光素酶报告基因实验

• 上下游关系图、定量PCR检测图

• 机制图/通路图

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