蛋白质定性定量分析技术

蛋白质定性分析：确定样品中是否存在蛋白质或是哪种蛋白分子

蛋白质定量分析：确定样品中蛋白分子的含量

蛋白分子量的测定：蛋白质在电场中的迁移率差异主要依赖于样品中各种分子携带的电荷、分子大小和形状的差别。要想利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品中某一蛋白质的分子质量，就必须排除电荷、分子形状的影响，使目的蛋白在电泳时的迁移速率只与蛋白质量相关。

蛋白质一级结构：氨基酸残基在肽链中的排列顺序。主要为肽键连接，有少量二硫键存在。

蛋白质二级结构：肽链按照一定的规律弯曲折叠（（如α-螺旋结构）或折叠（如β-折叠结构））形成一定的空间结构。主要依靠肽链中氨基酸残基亚氨基（—NH—）上的氢原子和羰基上的氧原子之间形成的氢键而实现的。

蛋白质三级结构：在二级结构的基础上形成更加复杂的空间结构。

蛋白质四级结构：具有三级结构的多肽链按照一定的排列方式结合在一起形成的聚集体。

蛋白质的变性：在物理、化学及生物因素的刺激下，蛋白质的高级结构被破坏，致使蛋白质的理化性质和生物功能发生改变。主要是二硫键被破坏。蛋白质变性主要涉及二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。

蛋白质的复性：蛋白质变性程度较轻时，在去除变性因素后仍可恢复原有的构象。

SDS是一种阴离子去垢剂，它能够破坏蛋白质中氢键和疏水键，并按照一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远大于蛋白质本身所带的电荷，从而掩盖各种蛋白质间天然的电荷差异。

巯基乙醇破坏蛋白质中的二硫键。巯基乙醇具有很强的还原性，能将二硫键还原为硫醇，即破坏了二硫键。

蛋白质含量测定：BCA定量法（二喹啉甲酸法）

原理：利用双缩脲反应原理，在碱性条件下，蛋白质肽键能够和Gu2+结合，反应生成Gu+，Gu+和BCA试剂反应形成紫色的稳定复合物，并在526nm处有很强的吸收峰。

BCA溶液：A液——含有氢氧化钠，最终PH为11.25，故提供碱性环境。B液——含有4％硫酸铜，提供Gu2+。

BCA优势：① 简单，只需一步操作；② BCA试剂在碱性环境中稳定；③ 不受去垢剂和变性剂的影响；④ 灵敏度高；

蛋白定量：取适量蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20µl，相当于标准品浓度分 别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。加适当体积样品到96孔板的样品孔中。各孔加入200µl BCA工作液，37ºC放置20-30分钟。酶标仪测定波长的吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

紫外光谱吸收的原理：核酸/蛋白在紫外区有两个吸收峰，一个吸收峰在280nm处，由芳香族氨基酸中苯环的共轭双键引起的，大部分蛋白质中的芳香族氨基酸含量差别不大，故可以用溶液在280nm处的吸光值推算蛋白含量；另一个吸收峰由肽键引起，在240nm以下时光密度急剧增加，215nm处的吸收率为280nm处的数倍。

结果分析：1、免疫印迹检测技术测定的蛋白含量不是绝对值，而只能确定目的蛋白是否存在或者在可比条件下该蛋白含量的高低。2、使用管家基因表达的蛋白对目的蛋白含量进行标准化。3、属于半定量分析。

SDS-PAGE

Western Blot (蛋白质免疫印迹)

含义：是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。根据电泳区分不同分子量的蛋白组分，并转移至固相支持物上，通过特异性抗体作为探针对靶蛋白进行检测。

BCA定量：二价铜离子在碱性条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和BCA相互作用产生稳定的蓝紫色复合物，在560nm处有吸光值，与蛋白质浓度成正比。

WB的优势：它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。

灵敏：由于它能够检测到样品中低至0.1纳克的蛋白质，因此该技术在理论上可以用作有效的早期诊断工具，甚至可以检测出患者样品中病毒或细菌产生的最小的免疫原性应答。

专一：蛋白质印迹技术的特异性归因于两个主要因素。首先，凝胶电泳将样品分为大小，电荷和构象不同的蛋白质。 这个过程本身就是朝着检测迈出的重要一步，因为凝胶中形成的条带已经为目标蛋白质或多肽的大小提供了线索。抗体-抗原相互作用的特异性是第二大因素。由于特异性抗体显示出对特定蛋白质的亲和力，因此该过程甚至可以在300,

1000种不同蛋白质的混合物中选择性检测目标蛋白质

缺点：容易产生错误或主观的结果