三维基因组组织结构在免疫细胞命运分化和功能中的作用（上篇）

摘要

免疫细胞的分化、发育和激活需要转录程序的精确和协调控制。基因组的三维（3D）组织结构已成为染色质状态、转录活性和细胞身份决定的重要调节因子，它可以通过促进或阻碍转录调控元件与靶基因之间的远程染色质相互作用来调控基因的表达。染色质折叠可使免疫细胞对胞外信号产生细胞类型特异性和刺激特异性的转录应答反应，这对于控制免疫细胞命运分化、炎症反应和产生各种抗原受体特异性应答是必不可少的。在此，我们系统回顾了3D基因组组织与免疫细胞分化和功能控制之间联系的最新研究进展，并讨论了3D基因组折叠的改变如何导致免疫细胞的功能障碍和恶性转化。

前言

在哺乳动物中，机体已经演化出了一个复杂的免疫细胞网络，它们既能中和清除病原体和恶性细胞，又能修复机体的组织损伤1。我们的免疫系统由多种功能特异的细胞类型组成，包括具有广泛特异性的快速反应先天免疫细胞（如巨噬细胞）和响应特定抗原的高度专业化的淋巴细胞（如T细胞）1。尽管存在这种异质性，但所有的免疫细胞都具有敏锐的感知周围环境的能力，并在面对微环境变化时迅速作出反应以适应新的环境。对于这种反应灵活性，免疫细胞主要依赖于将细胞外环境信号有效地传递到细胞核中来改变相应基因的转录程序2,3。基因转录程序的改变反过来又能改变免疫细胞的功能状态，包括增加炎症介质的产生或进入细胞周期。因此，免疫细胞已成为研究基因转录调控机制的范例。此外，免疫细胞的功能障碍或恶性转化是许多疾病发生发展的决定性特征，包括过敏、自身免疫性疾病和癌症等4。

基因表达的变化主要受与DNA结合的转录因子的调控5。细胞间通讯和微环境感知可以触发细胞内的信号级联反应，从而激活转录因子改变基因的转录程序，并塑造细胞表型。转录调控涉及多种类型的调节元件，包括位于基因转录起始位点上游的启动子和远距离控制转录程序的增强子等 6,7,8 。这些调节元件受到转录因子的结合，而转录因子的结合反过来又受到3D基因组组织结构的影响 9,10。DNA可以发生甲基化修饰，从而吸引或排斥特定的转录因子和调节蛋白。组蛋白将DNA包装到染色质中，DNA对转录因子的可及性受组蛋白的定位和翻译后修饰的控制。重要的是，染色质还可以采用细胞类型特异的三维 (3D) 基因组组织，在基因的转录调控中发挥着重要作用。在这篇综述中，我们重点讨论了3D基因组折叠如何影响基因的转录调控过程，以及调控免疫细胞分化、激活和功能障碍或恶性转化的最新见解。

三维基因组组织

当前模型

在过去的十年中，我们对3D基因组拓扑结构的解析取得了长足的进步，并对3D基因组结构的组织原则产生了新的认识。这场技术革命的核心是染色质构象捕获 (3C) 技术及其衍生的Hi-C技术的发展，它们使用化学交联后的邻近连接来构建细胞核的3D基因组染色质互作图谱 11,12 。当前3D基因组组织的主要模型是基于3C衍生技术的相关发现，该模型认为染色质在细胞核中会进行多个级别的层级折叠 13,14 （图 1）。其中，每条染色体在细胞核中都占据一个特定的区域，被称为染色体疆域。大多数情况下，在染色体疆域内，但也有跨领域的，基因组区域之间的兆碱基规模相互作用可以将染色质划分到不同的区室中。根据染色质含量的生化特征，可以将其区分为两种不同的染色质区室。其中，“A”区室主要位于染色质开放的区域，并富含转录活跃的基因，而“B”区室则主要由转录沉默的紧缩异染色质所组成。在核定位方面，A区室大多占据在细胞核的中心位置，而B区室则主要分布在外周的核纤层附近。在最初发现的A和B区室之后 15，人们基于组蛋白修饰特征和复制时间对其作出了进一步的改进，并在最近的一项研究中提出了更动态的中间型“I”区室的存在 16。染色质区室通常由称为拓扑相关结构域 (TAD) 的亚兆碱基结构所组成。TAD是基因组中空间绝缘的互作区域，在TAD结构域内部存在较强的自我相互作用，而与TAD边界外区域间的相互作用较少。通常，转录单元的所有调控元件（如启动子、增强子）位于同一TAD 内，并且它们之间可以产生短程的染色质相互作用。进一步的，人们对TAD内的相互作用进行详细分析，发现了“stripes”条纹结构的存在，这些“stripes”条纹似乎有助于强化增强子-启动子间的相互作用 17,18,19 。最近，Micro-C技术可以在单核小体分辨率水平解析3D基因组的染色质折叠，揭示了TAD内包含更精细的染色质结构，由stripes条纹、互作点和连接基因调控元件的小结构域所组成 20。

图1.三维基因组组织的层级结构

目前，关于3D基因组组织三个主要层级结构的形成机制正在深入研究中（图 1）。研究发现，大多数TAD结构是由称为环挤压的过程所形成的。其中，环状多亚基Cohesin蛋白复合物通过挤压染色质，直到它遇到两个朝向相对的CTCF蛋白分子与DNA相结合，形成以CTCF结合位点为锚定点的染色质环 21 。TAD内的短程染色质相互作用也被认为至少部分取决于环挤压过程 21 ，但它们也可能由转录因子同源二聚化或通过非编码RNA介导所形成5,22,23。相分离过程涉及调节蛋白（包括转录因子）或RNA分子之间的弱多价相互作用 24,25 ，已被认为与3D基因组层级结构的形成相关 25,26 。其中，异染色质关联蛋白HP1的相分离已被证明是染色质B区室形成的基础 27,28,29 ，而由各种转录激活因子（如RNA聚合酶 II、BRD4等 30 ）介导的类似过程可能有助于A区室的形成。转录因子及其共激活因子的相分离也被提出作为一种机制，通过将基因组调控元件聚集在一起形成局部互作中心或凝聚体来促进短程3D基因组互作折叠 6,8。

基因组拓扑结构和转录控制

基因组的拓扑结构和功能之间存在着紧密联系。尽管目前的模型存在一定的争议，但仍支持这样一种观点，即启动子和增强子之间的空间互作对于基因表达的时空调控很重要5,6,7,8,13,23,32,33（图 1）。TAD结构通过提供接触绝缘作用，可以促进（在TAD内）或阻碍（在TAD间）增强子与启动子之间的空间物理接近。目前，关于基因组区室化在转录控制中的作用仍不太清楚，尽管各种证据表明远程染色质相互作用和A/B区室的转变可能有助于转录控制。例如，通过为后续的转录调节提供开放的染色质环境。尽管剖析基因组拓扑结构和功能之间的因果关系仍然具有挑战性，但随着chromatin loop reorganization using CRISPR–dCas9 (CLOuD9)36, CRISPR-genome organization (CRISPR-GO)37 和light-activated dynamic looping (LADL)38等技术的开发，为人们提供了在哺乳动物细胞中设计拓扑结构的新方法，揭示了在染色质区室 37 或 TADs 39 水平上诱导的染色质相互作用可以指导特定生物环境中的基因调控。相反，强烈地转录抑制过程可能会减少3D基因组结构的形成20,40,41,42 。尽管存在这些复杂和未完全理解的因果关系，但很明显，基因组的组织结构和功能之间存在动态的相互作用关系，这与建立和维持基因的表达程序是必不可少的5,6,7,8,13,23,32,33 。事实上，随着细胞命运状态的转变，基因组的拓扑层级结构会发生较大的改变，并且这些改变与染色质状态和基因表达动态变化密切相关5 。在这种情况下，一个值得注意的问题是，特定基因的转录程序是如何依赖于远程增强子元件的调节的（即由3D染色质折叠所介导）。小鼠免疫细胞表观基因组特征的综合分析，将基因分类为以近端启动子驱动或远端增强子驱动的方式进行调节 43 ，后者可能更多地依赖于3D基因组的拓扑结构。

免疫细胞发育中的基因组拓扑结构

造血干细胞和祖细胞中的3D基因组组织

造血系统为探索细胞命运分化的基因调控机制提供了有吸引力的模型。造血干细胞 (HSC) 每天产生数十亿个成熟的血细胞，包括所有主要的免疫细胞类型（图 2）。这一过程需要对数千个基因进行精确和协调的调控，以响应微环境信号。最近的研究已经开始探索3D基因组组织结构在免疫细胞命运分化中的调节作用。

图2.造血干细胞的分化发育

在出生前，胚胎肝脏中的HSC细胞会迁移到骨髓中，并在成年后仍保留在那里。由于存在不同的转录程序，这些HSC细胞亚型会表现出不同的增殖能力和分化潜能。在小鼠中，胚胎肝脏HSC和成年骨髓HSC细胞之间的基因组拓扑结构在很大程度上是保守的，但后者显示出更稳健的染色质区室化和更强的TAD边界强度 44 。然而，时期特异性的增强子-启动子相互作用仍广泛存在，并且与胚胎肝脏HSC和成年骨髓HSC细胞之间表型差异背后的基因转录调控有关，包括那些参与细胞周期控制的基因 44 。HSC细胞通过几个祖细胞阶段的顺序分化，最终分化发育为成熟的免疫细胞。有趣的是，人们在小鼠原始干细胞和祖细胞中，发现了一些缺乏DNA甲基化的大片段区域中形成了兆碱基规模的染色质环，并且它们是独立于环挤压过程形成的 45。这些DNA甲基化“峡谷”区域富含组蛋白H3K27me3修饰，这是其干细胞身份决定基因转录控制所必需的 45 。Hi-C数据分析的结果显示，在小鼠HSC细胞分化过程中，基因组染色质区室结构发生了动态重排，染色体的凝聚度逐渐增加，并伴随着Rabl结构的出现，即着丝粒被束缚在细胞核的一极 46 。小鼠造血细胞中组蛋白H1的体内缺失实验支持了染色质B区室中基因组浓缩与免疫细胞成熟之间的联系，该证据显示组蛋白H1缺失后成熟淋巴细胞的数目大量减少，同时染色质的压缩程度和B区室化也大规模降低 47 。事实上，在造血祖细胞向中性粒细胞分化的过程中，基因组会在转录沉默的区域之间产生强烈的远程染色质相互作用，从而导致染色质压缩增加 48 。有趣的是，人们发现ZNF143转录因子的结合控制着造血祖细胞中局部CTCF位点的结合，使得ZNF143–CTCF介导的增强子–启动子染色质互作环调节干细胞维持基因的表达 49 。在较小的尺度上，与基因体区域重叠的强而均匀的相互作用域（称为基因体相关结构域）出现在不同的造血细胞中，并且这些基因体相关结构域独立于CTCF蛋白而形成。人们在高表达的基因处观察到了基因体相关结构域，并且发现它们在造血细胞分化过程中与基因表达的动态变化相关 46 。

淋巴细胞发育过程中的3D基因组动力学

共同淋巴祖细胞(CLP)可以在骨髓中进一步分化为B细胞和先天淋巴细胞(ILC)，或迁移至胸腺中分化为T细胞。B细胞和T细胞的发育与TCR受体位点的重排密切相关，涉及在特定发育阶段V、D和J基因片段的逐步重组，以组装成一个功能性抗原特异性受体（图 2）。有趣的是，通过谱系特异性转录因子和环挤压因子的协同作用来控制TCR基因位点的3D染色质构象，对于确保高效和多样化的TCR重组是至关重要的。已有研究表明，在早期B细胞的发育过程中，基因组的拓扑结构发生了大量的改变 50,51,52。Murre实验室的开创性工作表明，早期小鼠B细胞祖细胞的分化与数百个基因在染色质A区室和B区室之间的相互转换有关 52 。其中，Ebf1 基因座（编码B细胞关键转录因子EBF1）在转录激活时会从外周核纤层的非活性B区室转移到转录活跃的A区室中 50,52 。在早期 B 细胞的染色质区室中，转录因子的结合位点经常在核空间中共同定位，形成两类独立的相互作用中心 52 。其中，第一类包括通过环挤压形成的CTCF-Cohesin位点之间的短程（<1Mb）细胞类型不变相互作用，而第二类涉及由B细胞转录因子（E2A和PU.1）结合区域之间的远程（>1Mb）发育调节相互作用52 。PAX5是调控B细胞身份决定的主转录因子，对于B细胞发育过程中3D染色质结构的建立与维持至关重要，因为小鼠中缺乏PAX5的pro-B细胞在基因组局部和远程相互作用中都表现出广泛的变化。有趣的是，PAX5介导的基因组折叠是独立于正在进行的转录程序而建立的51，它通过Cohesin释放因子WAPL的直接转录抑制促进环挤压过程53。在B细胞发育过程中，B细胞转录因子被顺序的招募到调控元件中，诱导多个增强子之间的协同启动子相互作用，有助于基因转录程序的增强 55 。在小鼠 B 细胞祖细胞中，CTCF缺失或选择性删除特定的CTCF结合位点也会导致异常的增强子-启动子相互作用和基因表达，从而导致B细胞分化发育缺陷 56,57 。

与 B 细胞相类似，T 细胞也遵循逐步分化的发育轨迹，由转录因子的组合调控所监管，最终分化发育为成熟的初始CD4 + 和CD8 + T细胞 2 。 BCL11B是T细胞谱系决定的核心转录因子。与B细胞发育中的Ebf1 转录因子类似，小鼠T细胞分化过程中Bcl11b基因的转录激活涉及从核膜相关的染色质B区室转移到到A区室中 58 。这种A/B区室的转变是由非编码 RNA(ncRNA) -胸腺细胞分化因子(ThymoD)精细调控的。 具体的，ThymoD非编码RNA的转录促进了局部 DNA的去甲基化，从而允许 CTCF的募集和Cohesin粘连蛋白介导的环挤压过程，将Bcl11b基因的启动子和增强子元件聚集到一个单一的环结构域中58 。不同的转录因子，包括 RUNX 蛋白，已被证明可介导Cd4和Cd8基因位点的远程空间共定位，这可能有助于它们在 T 细胞发育后期形成相互排斥的基因表达模式 59 。Hi-C数据分析的结果显示，小鼠T细胞在不同发育阶段的3D基因组结构发生了广泛的重塑。首先，关键转录因子（如Ets1和 Meis1）编码基因所在的染色质区室发生了转换；其次，TAD内相互作用强度的变化与T细胞谱系分化和基因转录水平相一致。BCL11B可以在初始T 细胞中介导TAD内的染色质相互作用 60 ，而E2A则可以通过招募CTCF-Cohesin控制Rag1-Rag2基因位点（编码 VDJ 重组激活基因 (RAG)）处的远程增强子-启动子相互作用 61 。早期小鼠 T 细胞祖细胞中 Cohesin 或 CTCF蛋白的缺失会导致调控元件（包括超级增强子）之间相互作用的丧失、异常的基因调节和细胞分化受损 62,63,64 。有趣的是，近期人们发现另一个对早期 T 细胞发育至关重要的转录因子TCF1，可以通过调节Cohesin蛋白的加载从而破坏 TAD 边界的绝缘作用 65。此外，人们还发现其他染色质相关蛋白也参与了 T 细胞发育过程中3D基因组拓扑结构的重塑。例如，SATB1蛋白可以在异染色质周围形成一个笼状结构，它选择性地将特定的 DNA 序列束缚在异染色质上进行转录调节 66 。组蛋白甲基转移酶MLL4可以促进 T 细胞中转录调节区域之间的染色质相互作用 67 。

图3.免疫细胞分化过程中基因组拓扑结构的动态变化

总之，这些研究表明染色质相关蛋白的结合、谱系特异性转录因子、3D染色质重塑和免疫细胞分化过程中的转录控制密切联系（图 3）。对转录因子驱动的B细胞重编程或转分化的研究进一步支持了这一观点。这些研究发现，细胞在分化发育的过程中其3D基因组结构会发生大量的重塑，并且常常先于基因表达的变化，伴随着谱系特异性转录因子形成的3D染色质交互中心68。令人惊讶的是，尽管Cohesin粘连蛋白介导的拓扑结构对人单核细胞的分化很重要 69 ，但转录因子介导的人B 细胞向巨噬细胞转分化的过程可以在没有CTCF蛋白的情况下实现 70 ，表明CTCF介导的环挤压和TAD结构不是广泛转录重塑的先决条件。

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参考文献：Cuartero S, Stik G, Stadhouders R. Three-dimensional genome organization in immune cell fate and function. Nat Rev Immunol. 2023 Apr;23(4):206-221. doi: 10.1038/s41577-022-00774-5.