Nature | FOXA1突变通过改变染色质可及性影响前列腺癌病理表型分化

文献链接：FOXA1 mutations alter pioneering activity, differentiation, and prostate cancer phenotypes
发表期刊：Nature
影响因子：69.504
发表时间：2019年7月

实验设计思路

（1） 荧光报告基因探针筛选目标突变：

• 筛选与野生型存在显著差异的突变类型

（2）小鼠野生型或突变型前列腺类器官培养：（dox诱导的慢病毒构建小鼠FOXA1等位基因）

• 观察组织学差异并通过RNA-seq方法验证；
• 基于ATAC-seq观察染色质可及性差异并基序分析，通过CHIP-seq的方法验证

研究背景

• 膀胱癌患者中FOXA1体细胞突变占比高：通过对3086个膀胱癌原发或转移的患者数据进行研究，发现膀胱癌患者中存在FOXA1基因变异的比例约为11%，其中3%为基因扩增，8.4%为体细胞突变，＜1%的患者同时存在基因扩增和体细胞突变（图1a,b）
• FOXA1突变在某一区域显著富集：超过50%的FOXA1突变位于FKHD-DNA结合域中的wing2(hotspot)区域（图1a）；在一个MSK - IMPACT 504研究队列里，发现wing2 热点突变是最常见的亚类，在所有疾病阶段都有发现，同时在原发性局部区域频率更高（图1c）
• FOXA1突变与特定病理类型呈现协同状态：对1822例患者数据分析 ，区分其病理亚型“神经内分泌型和腺癌型”，获得图表1d；可以看到FOXA1 R219点突变显著出现在NEPC病理类型的患者

图1. 前列腺癌集群中FKHD DNA结合域的复发性FOXA1突变簇

1. 类器官模型验证R219变异激活神经内分泌转录程序

报告基因实验：常用于研究目的调控元件（启动子、增强子等），调控元件的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
整个报告基因的核心是将待定的调控元件与报告基因进行融合，由于报告基因的表达完全取决于待定的调控元件，故 报告基因的表达量 与 待定调控元件的活性 直接相关。

图2. FOXA1报告基因实验设计

• 通过荧光报告基因探针筛选目标突变：与野生型相比，所有的Wing2突变，D226N，G275X突变的转录活性增加，而R219突变显示转录活性降低（约为WT的50%），参考图3a
• FOXA1突变型的类器官生长速度更快：类器官培养设置了EGF（表皮生长因子） 和 no-EGF，明显看到野生型的生长速度高于EV载体对照组（图3b），同时，几乎所有的FOXA1突变型的生长速度高于FOXA1野生型（图3c）
• FOXA1突变导致类器官组织学特征分化：FOXA1WT, FOXA1D226N , Wing2 hotspot mutations的高表达都促进了管腔的形成和管腔面积增大（图3d-e）；相比之下，表达FOXA1R219S和FOXA1R219C的类器官不能形成可测量的腔，基底的双层取向（p63+）和腔细胞层（AR+）细胞层被破坏（图3e）；作者在FOXA1内源性缺失型的类器官中（FOXA1F254_E255del 和 FOXA1D226N）重复了上述过表达研究，发现腔前表型并没有变化。RNA数据分析也和组织切片观察的形态相似。FOXA1R219S 表现出上皮-间充质转化（EMT）基因集的高表达和ETS突变基因集的低表达（图3f），与它独特的形态相一致

图3. FOXA1突变体的表达促进了生长，并揭示了不同突变类型改变类器官的组织形态

2. 类器官模型验证FOXA1会在某些位点取代AR的功能

考虑到FOXA1是AR的辅助因子，并且TCGA队列中的FOXA1突变病例比正常样本或其他亚型患者有更高的AR评分。因此作者对各类野生型或突变型小鼠前列腺癌类器官模型通过CHIP-seq的方法测试AR结合峰的数量。

• FOXA1会在某些位点取代AR的功能：在过表达野生型或突变型FOXA1的类器官中，AR结合峰的数量（由ARChIP-seq定义）显著减少（图4a左），FOXA1结合在AR结合位点显著增强（图4a右），AR基因在CRISPR缺失后，FOXA1表达增加仍然会促进类器官的生长优势（图4b）
  

  图4. FOXA1的表达限制了AR顺式体，并促进了AR独立的生长程序

3. ATAC-seq发现R219突变表达细胞与非典型基序（GTAAAG/A）富集

考虑到FOXA1具有先驱转录因子的作用，作者通过ATAC-seq的方法分析全基因组水平的染色质可及性

• FOXA1突变型类器官模型染色质可及性差异响应更即时：在第五天后才能检测到FOXA1WT 的高表达才导致染色质可及性峰显著增加，而FOXA1F254_E255del和FOXA1R219S 的类器官模型在第一天便可以检测到染色质可及性的显著增加（图5a）
• R219突变型存在显著不同的染色质开放区：无监督据类发现FOXA1F254_E255del和FOXA1R219S 存在不同的cluster：cluster0的显著特征为FOXA1WT和FOXA1F254_E255del 染色质开放区域增大；FOXA1R219S 在cluster3和cluster5表现为染色质峰的数量显著增加（图5b）
• R219突变表达细胞与非典型基序富集：ChIP-seq验证后显示，FOXA1蛋白在这些相同的ATAC-seq位点上结合，而特异性突变型的FOXA1存在一些新的染色质可及性峰（图5c）；通过denovo motif分析发现，cluster3,5 与（G/A）基序选择性富集，cluster0,1与（C/T）基序选择性富集（图5d）

结论验证：通过荧光报告DNA探针对图5d的发现进行验证，可以看到FOXA1R219S 会优先激活存在（G/A）偏倚的DNA，而FOXA1WT和FOXA1F254_E255del 在典型（C/T）序列上表现出显著更高的活性，这表明了FOXA1R219S选择性靶向新的基因组位点的机制。

图5. FOXA1突变导致染色质可及性变化

Postscript：进一步研究这些突变体对不同基序的相对DNA结合亲合力，以及Wing2结构域在这种保留的DNA结合中的潜在作用（基于已知的通过小凹槽的DNA接触）都是有必要的。在这两类突变中，生物学后果是促进/抑制腔程序的谱系可塑性。