围观！研究者开发出让T细胞进入到“冷”肿瘤的策略

前言

CAR-T疗法在恶性血液肿瘤中展现出了巨大的潜力和应用价值，然而针对实体肿瘤，CAR-T在实体瘤的免疫抑制微环境中却难以发挥作用。

给予大剂量的炎性细胞因子，或维持T细胞功能的细胞因子是逆转肿瘤抑制微环境的重要手段，如IL-2补充可增强T细胞活性进而驱动强大的抗肿瘤功能。然而全身性的IL-2治疗被证实具有极高的毒性，可引起严重的不良反应，包括毛细血管渗漏综合征和多器官衰竭。

那么如何使工程化T细胞克服肿瘤抑制作用，同时减少脱靶和全身毒性作用呢？

近期来自加州大学旧金山分校细胞与分子药理学Wendell A. Lim教授团队利用最近开发的合成Notch (synNotch)受体创建了一个旁路信号通路，即肿瘤特异性synNotch受体局部诱导细胞因子IL-2产生的回路，这个环路可有效增强CAR-T细胞浸润和免疫排斥型肿瘤的清除，成果发表在Science上[1]。

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我们首先来看什么是synNotch——在配体诱导激活之前，Notch被一个夹在配体结合区和跨膜区之间的保守NRR维持在静息态，金属蛋白酶抗性构象。Notch的激活是由DSL家族的跨膜配体与Notch外结构域的EGF重复区域结合而触发的，这一过程诱导了蛋白水解级联。触发级联反应的关键蛋白水解事件是ADAM型金属蛋白酶在S2位点的近膜裂解。S2的裂解是γ-分泌酶在S3位点裂解的前提，S3位点裂解后Notch的胞内部分从膜上释放出来，移动到细胞核中并调节基因转录[2]。

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基于Notch受体的明显模块化，研究者通过交换这些受体的细胞外识别域来定制输入感知，包括使用基于抗体的域(例如单链抗体或纳米抗体)来检测多种用户指定的细胞表面蛋白，例如疾病抗原。同时，通过交换细胞内转录域和提供特定的下游效应靶基因，我们可以将这些新的输入连接到定制的应答。synNotch受体只保留了天然Notch的最小跨膜核心结构域，该结构域介导蛋白水解的控制[3]。

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主要内容

在本文中，研究团队利用最近开发的synNotch受体创建了一个旁路信号通路，synNotch对肿瘤的识别可诱导局部白细胞介素-2 (IL-2)的产生。这是以肿瘤靶向但不依赖TCR/CAR信号通路的方式提供IL-2，意图绕过肿瘤免疫抑制。

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1. 工程化合成IL-2环路驱动T细胞增殖独立于T细胞活化

在体外刺激synNotch受体可诱导工程细胞群的增殖(图1C)。

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在体内实验中，研究者在NSG鼠中建立了双侧K562肿瘤模型，其中只有一侧的肿瘤表达synNotch靶抗原CD19(图1E)。将抗cd19 synNotch→sIL-2通路修饰的CD8+ T细胞用eff-luc标记并静脉注射。具有synNotch-IL-2回路的细胞自主识别靶肿瘤(CD19+/右)，并在肿瘤内局部扩增约100倍(图1E)。工程化的T细胞对肿瘤无CAR或TCR反应性，因此在这一免疫缺陷NSG小鼠模型中，单独合成IL-2未导致K562肿瘤被杀伤(图S2D)。这项工作代表了synNotch-IL-2工程化T细胞能够以与TCR或CAR激活不耦合的方式诱导局部靶向T细胞扩增。

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2. 合成IL-2环路在体内可增强靶向T细胞的细胞毒作用

研究者给synNotch-IL-2环路T细胞设计一种新型的AND门，治疗性T细胞在触发其充分的细胞毒性反应之前需要识别两个抗原：T细胞活化所需的TCR抗原和诱导IL-2产生所需的synNotch抗原。 在这种情况下，我们使用了anti GFP-synNotch→sIL-2合成细胞因子回路。通过要求TCR抗原(NYESO-1)和synNotch抗原同时存在(图1F)。当同时表达anti-NY-ESO-1 TCR和anti-GFP synNotch→sIL-2环路的T细胞治疗小鼠时，双靶向的NY-ESO+/GFP+肿瘤体积显著减小。

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为了研究在完全免疫正常的小鼠肿瘤模型中局部IL-2产生的影响，研究者在原代小鼠T细胞中构建了anti-mesothelin CAR与synNotch-IL-2环路同时表达 (图2A)。能观察到CAR-T细胞介导的肿瘤消退（图2C）。

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3. 合成的IL-2回路驱动T细胞浸润到免疫排斥肿瘤中

为了进一步说明肿瘤消退的机制，研究者收集了肿瘤消退初期和中期(分别为T细胞治疗后第8天和第23天)的KPC胰腺肿瘤标本，并使用免疫组织化学检测CD3+ T细胞浸润。使用标准anti-mesothelin CAR-T细胞治疗的肿瘤显示出典型的免疫排斥表型，肿瘤核心内的T细胞浸润非常有限，大多数T细胞聚集在肿瘤外周(图4，顶部)。相比之下，使用含有合成自分泌IL-2回路的CAR-T细胞治疗的肿瘤显示，整个肿瘤核心的T细胞浸润显著增加(图4，底部)。

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用质谱流式（CyTOF）对切除和分离的肿瘤进行分析。工程化合成IL-2回路的T细胞(表达CAR和synNotch→IL-2通路)驱动CAR-T细胞和宿主T细胞的大量瘤内浸润(图5A)。CyTOF的无监督聚类确定了工程化合成IL-2回路的T细胞主要富集了活化的CAR-T细胞群(图5B)。合成IL-2回路还改善了浸润肿瘤的CAR-T细胞的表型，包括上调T细胞活化(CD25)、效应活性(Granzyme B)和增殖(Ki67)标记物，耗竭标志物(Tim3、Lag3、PD-1)表达减少(图5C)。

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展望

综上所述，肿瘤特异性synNotch受体驱动IL-2的产生。这种靶向肿瘤的IL-2递送回路提供了一种潜在的方法，可以在局部克服肿瘤抑制，同时将全身性IL-2治疗的毒性降到最低。

此外，用synNotch受体系统可以快速建立有效和持续的T细胞应答所需的TCR和IL-2通路活性。与IL-2递送的其他机制相比，将IL-2的产生受一种TCR非依赖性但仍然靶向肿瘤的合成受体的控制，可以绕过肿瘤免疫抑制，在进入肿瘤后立即和持续地产生IL-2。本篇文章提供了工程免疫细胞疗法的一种方案，使其能够在不利的肿瘤微环境中更有效地发挥作用。

[参考文献]

1. Allen GM, Frankel NW, Reddy NR, Bhargava HK, Yoshida MA, Stark SR, Purl M, Lee J, Yee JL, Yu W et al: Synthetic cytokine circuits that drive T cells into immune-excluded tumors. SCIENCE 2022, 378(6625):a1624.
2. Gordon WR, Vardar-Ulu D, Histen G, Sanchez-Irizarry C, Aster JC, Blacklow SC: Structural basis for autoinhibition of Notch. NAT STRUCT MOL BIOL 2007, 14(4):295-300.
3. Morsut L, Roybal KT, Xiong X, Gordley RM, Coyle SM, Thomson M, Lim WA: Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors. CELL 2016, 164(4):780-791.