qPCR引物设计与验证

引物设计是 qPCR 非常重要的环节。今天小编给大家推荐 2 款简单实用的在线 qPCR 引物设计网站，让你分分钟搞定 qPCR 引物！

Primer3 Plus

严格的 qPCR 引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在 3' 端设计引物，产物的长度在 300bp 以内等。本在线软件可满足 qPCR 引物设计的要求。

网址链接：http://www.primer3plus.com/

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1、选择 Run latest Versionof Primer3Plus，就进入了设计引物的主页面，合理的使用<>，［］，｛｝ 符号使引物设计符合自己的要求，大家可以在具体实战中，深入体会这几个符号带来的方便。

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2、避免多个重复碱基出现，避免 4 个或超过 4 个 G 出现在引物序列中。按照荧光定量引物要求设置参数，如产物长度：不应该超过 400bp，最好 100 - 150bp；GC%：30%- 70%，最好 45%－55%；引物长度：18 - 25bp，最好 22 - 24bp；TM 值：58 - 60℃，最好 60℃；3' 端：3' 端至少 4 个碱基保守，最好为 T，C，G。

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3、点击右上放绿色按钮 Pick Primers，可获得若干对引物，并按照 5' 到 3' 的顺序，包含了引物和产物的一些基本参数。可以根据荧光定量引物要求，尽量选择 G、C 结尾的引物合成，如下图中红框所示，还可以在序列图中看到引物的位置。

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4、设计好引物后，我们要进行 NCBI blast 引物验证，进入 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

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5、点击 Basic BLAST 中的 Nucleotide BLAST 选项，在下面框中，按照 5'－3' 顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔 20 个以上 n。

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6、选择物种数据库，如 Human，Mouse 或者 Others（如果是非人和非小鼠物种）。

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7、选择 Somewhat similar sequences(blastn)

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8、点击 Algorithm parameters, 在 Expect threshold 输入 1000，在 Word Size 输入 7。Word size 不是字体大小的意思，应该理解为读长，按照 7 个一组核苷酸序列放到 GeneBank 中进行比对。

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9、点击 BLAST，开始比对，出现结果。颜色代表得分，选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。

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Primerbank

哈佛大学的一个 qPCR 引物数据库，目前有超过 20 万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为 82.7%。尽量选择这种验证过的 qPCR 引物，qPCR 品质比较有保障。

网址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

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搜索类型这里，可以根据 GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol 以及 keyword 六个选项进行搜索。以小鼠的 beta-actin 为例。

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1、首先，到 NCBI 上找出β-actin 的 gene ID，如图，选择 gene, 输入 beta-actin：

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点击右边的分类 musmusculus：

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结果就出来了，小鼠 beta-actin 的 NCBI gene ID 是 11461，而 actb 则是小鼠 beta-actin 的 NCBI gene symbol。

2、把 11461 输入到 primerbank 里面试试：

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在这个结果上我们可以看到 beta-actin 的 NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length 等信息。

3、若是改输入 beta-actin 的 NCBI gene symbol：actb，也可以得到相同的结果，往下拉我们还能看到经过验证的引物：

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4、点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息：

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