干货分享：如何选择血浆游离RNA提取试剂？

        游离RNA(cell-free RNA，cfRNA)是指存在于体液中细胞外的内源性或外源性RNA，包括mRNA、lncRNA和miRNA等。其中血浆游离mRNA、lncRNA由于携带丰富的信息，逐渐成为液体活检的重要组成部分。想要高效又高质量的提取出血浆游离RNA，我们要搞清楚血液来源样本的类型有哪些，血浆游离RNA提取方法如何选择，试剂盒的选择标准是怎样的？

一，什么是外周血，什么是全血，什么是血清，什么是血浆？

        新鲜的血液（也叫全血，医学上称为外周血）加入抗凝剂（如柠檬酸钠，EDTA等，一般医院采血都是用抗凝管采集），静置一段时间，会出现分层的现象。上面淡黄色的半透明液体是血浆，约占55%，下面暗红色不透明的是红细胞，约占45%。中间薄薄的一层白色物质是白细胞和血小板，不到1%。红细胞、白细胞、血小板共同组成了血细胞。

特别提示：不加抗凝剂的血液很快就会凝成血块，在凝血块周围出现的淡黄色的透明液体是血清，血清中不含纤维蛋白原。

简单来说，全血包括血浆和血细胞（红细胞、白细胞、血小板），血浆包括血清和纤维蛋白原。

二，血浆游离RNA含量过少，选择何种方法提取？

       常用的血浆游离RNA提取方法主要有酚-氯仿法、硅胶磁珠吸附法(磁珠法)以及硅胶膜吸附柱法(柱式法)，其中酚-氯仿法由于其毒性大、提取效率低、重复差等特点并不适宜用于血浆游离RNA提取。目前主要用于血浆游离RNA提取的方法以磁珠法和柱式法为主。由于提取原理上的缺陷，磁珠法的提取富集度和灵敏度远不如离心柱法，而即使是离心柱法，目前也存在富集倍数偏低的问题。但要获得大量高浓度的游离RNA，柱式法是目前唯一的选择。一些生物公司如Qiagen、Takara、Biog等都研发出了比较不错的血浆游离RNA提取产品。

三、血浆游离RNA试剂盒的选择标准？

1）较高的提取得率较高的提取得率

       在实验试剂的选择中，如果选择不谨慎，很有可能导致提取的RNA浓度过低将无法进一步分析，如基因克隆、基因检测、微生物核酸检测、测序、分子杂交等，所以选择正确的试剂非常关键，可以直接提高实验的成功率。Qiagen、Takara、Biog等公司都具有较为先进的技术，可使血浆游离RNA获得较高的提取得率。其中，国内Biog所研发的血清血浆游离RNA提取试剂盒（中提）可高效富集提取液体样本中的低丰度游离RNA，较普通试剂盒的提取浓度大幅提升3倍以上，有效克服了一般试剂盒样本量大、洗脱液多、RNA 提取终浓度依然较低的缺点，可广泛用于Northern杂交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA 文库构建、测序等各种常规分子生物学实验。

2）提取的RNA纯度高

　　核酸纯度一般根据A260/A280比值来判断。A260/A280是指DNA或RNA在260nm处的吸光值与在260nm处的吸光值的比值，用来表示DNA或RNA的纯度的。纯RNA的A260/A280=2.0。当样品被蛋白质或者酚污染的话，A260/A280值会下降。RNA样品被DNA污染的话，A260/A280值会下降。

       使用国外Q公司血浆RNA提取试剂盒提取的血浆RNA，A260/A280一般在1.8-1.9之间；使用BIOG血清血浆游离RNA提取试剂盒（中提）提取的血浆RNA，A260/A280一般在1.8-2.0之间，使用T公司血浆RNA提取试剂盒提取的血浆RNA，A260/A280比值在1.7-1.9之间。Q公司提取RNA的纯度似乎优于国产试剂，但我们提取的RNA是用于PCR检测，结果并无明显影响。可能因为Biog公司血清血浆游离RNA提取试剂盒（中提）提取的血浆RNA得率较高的原因，同样的RNA加样体积（2uL），Biog试剂盒提取的RNA荧光定量PCR检测结果CT值要优于Q公司试剂盒提取的RNA。

3）操作简便性

　　就我们曾经用过的以上三种提取试剂盒来说，Q公司的血浆RNA提取试剂盒提取过程大约35min，从样本处理开始需要个13步骤；T公司血清/血浆游离RNA提取试剂盒整个提取过程需要约50min，从样本开始处理11个步骤；Biog公司的血清血浆游离RNA提取试剂盒（中提）提取过程大约25min，从样本开始处理10个步骤。可见Biog公司的血浆游离RNA提取试剂盒（中提）在操作简便性上具有一定优势，更适合于较多样本的检测。