超级实用~低生物量的样本如何进行污染控制

上次小编主要介绍了低生物量比如口腔、阴道等样本的常见微生物和污染物，但是测序技术的高灵敏度也放大了样本中DNA污染的影响，那么对于低生物量的样本如何进行污染控制就至关重要了~

2019年在《Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations》文献[1]中率先提出了针对低生物量样品的污染控制理论，主要是低生物量样品污染处理的详细流程，简化了污染的处理方法，如下是详细描述：

01

减少污染的实验设计： 

样品中的 DNA 在洁净室环境中提取，使用超净试剂盒和试剂，并在不同的指定区域进行 PCR 前后实验。 

02

控制污染DNA：

记录阴性对照样本，如：不同国家地域，不同医院，不同类型的样本，批次来源（地址来源、DNA 提取批次，PCR 扩增批次和测序文库编号）。把阴性对照纳入每个批次类型，能够检测不同类型的批次效应。

同时提出了RIDE checklist，目的是提供给研究者一个可参照的开展低微生物量样本的微生物组研究的最低标准检查表

这个检查表包括四部分内容：

01

Report 设计用于减少污染并评估污染影响的实验设计和方法；

02

Include 包括评估污染DNA的控制措施。每批取样、核酸提取以及扩增必须包括一种类型的阴性对照(取样空白对照、DNA提取空白对照和无模板扩增对照)；

03

Determine 通过将生物样本与对照进行比较来确定污染程度；

04

Explore 探索每项研究中的污染菌群，并报告它们对生物样本解释的影响。

图 在低微生物生物量中尽量减少污染DNA的方法流程

其实了解了这么多，目的是对低生物量微生物群落研究提出一些建议，来尽量避免污染[2-3]:

1. 尽可能通过选择样品类型、过滤或浓缩使初始样品生物量最大化。如果微生物负荷小于大约103至104个细胞，由于污染占主导地位，可能无法获得可靠的结果。

可以利用革兰氏染色、荧光原位杂交(FISH)、qPCR或其他测序之前DNA定量的方法来优化结果。

2.在样品采集时将污染的风险降至最低。

3.每批样品，每种提取试剂盒和每种PCR试剂盒，都进行阴性对照与目标环境样品同时进行收集处理及测序。

4. 样品应以随机顺序处理，以避免产生错误的模式，理想情况下应重复进行，应使用不同的试剂盒/试剂批次进行处理。

5.应记录使用哪个试剂盒处理哪个样品，以便可以将特定试剂盒批号的污染追溯到最终数据集。

6. 阴性对照样品定量应在处理的各个过程中都进行，以监测污染的发生。

7.测序后，要注意阴性对照中的分类单元，统计上与特定批次试剂相关的分类单元，以及生物学上无意义的分类单元，与之前报道的污染物相一致的分类单元。

8. 如果认为可疑污染的菌群确实存在有意义，则应该使用不同批次的DNA提取试剂盒/试剂进行重复测序，理想情况下，应该用非测序方法(如传统培养或使用适当的探针进行原位杂交)来进一步证实他们的真实存在。

参考文献

[1] Eisenhofer R,Minich JJ,Marotz C, et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. Trends Microbiol. 2019

[2] Salter S J, Cox M J, Turek E M, et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.BMC biology, 2014

[3] Nejman D,Livyatan I,Fuks G, et al. The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science. 2020