浅谈如何选择热启动Taq酶

我们在PCR实验中和各种酶打着交道，Taq酶就是最常用的一种酶，随着科学技术的发展，实验试剂也在不断改良与优化中，热启动Taq酶正在以绝对的优势取代普通的Taq酶。那么对于热启动Taq酶，大家又了解多少呢？你知道热启动Taq酶的特点以及选择标准吗？

一、什么是Taq酶？什么是热启动？什么是热启动Taq酶？

Taq DNA Polymerase简称Taq酶，是一种来源于嗜热细菌Thermus aquaticus的热稳定DNA聚合酶。Taq酶可以催化5'至3'方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合，是最常用的DNA聚合酶之一。它的最大特点就是可以在高温下工作，95℃孵育时的半衰期大于40分钟，被鉴定为能够承受PCR期间所需蛋白质变性条件（高温）的酶。

传统PCR中，反应体系的各组分（Taq酶、dNTP、引物等）会一并加入并进入循环，在反应温度由室温升高至94～95℃过程中，引物在低温下就会结合到非特异性序列上，导致DNA模板被非特异性扩增。

热启动PCR技术的出现很好的解决了这个问题。将Taq酶的加入时间推迟到第一个循环的退火步骤。因为只有在90℃以上的初始变性步骤之后才能开始扩增，所以该技术被称为“热启动”。而这种Taq酶经过了严格的化学修饰，室温条件下，酶活性被完全封闭，在95℃热激活之后才会被完全释放活性，故称之为“热启动Taq酶”。

二、热启动Taq酶的特点

1、避免非特异性扩增

使用普通Taq酶进行PCR反应时，DNA模板可能在低温下就被扩增，导致非特异性扩增。热启动Taq酶能够在低温下被抑制，从而避免非特异性扩增。这种抑制可以通过热敏性的抑制蛋白或化学方法来实现，有效阻止了在加样阶段和升温阶段经常发生的非特异扩增。

2、提高PCR产物的特异性

热启动Taq酶在高温下被激活，从而在PCR反应的初始阶段提高了酶的活性，并在模板DNA的嵌合期间增加了反应的特异性。热启动技术提高了PCR反应的选择性、灵敏度和特异性，从而可以获得更精确的PCR产物。

3、增加PCR反应的稳定性

热启动Taq酶的活性在高温下被激活，可以提高PCR反应的稳定性。这种活性的提高可确保反应在早期和中期的稳定性，并保证PCR反应的高产出和高特异性。热启动技术还可以减少PCR反应的波动性，增加反应的稳定性和可重复性。

4、优化PCR反应的参数

热启动Taq酶可以优化PCR反应的参数。有些模板DNA需要在高温下被完全变性，以确保反应成功。热启动技术还能消除PCR反应的条件限制，这使得PCR反应对噪声和杂质的扩增更具选择性和纯度。

三、热启动Taq酶的选择标准

选择扩增效率高的热启动Taq酶。

PCR扩增效率与热启动Taq酶的性能密切相关，好的热启动Taq酶反应体系经优化后，扩增效率在95%以上，起始模板量扩增范围宽。在目标基因含量较低时能够获得满意的扩增，在模板量较高时，也不易中毒，指数扩增期较长。而性能较差的Taq酶，即使反应体系经多次优化，扩增效率仍达不到90%，扩增曲线“S”型不明显，斜率较小，曲线低平。模板量较低时扩增不出来，较高时扩增效果也不理想。

Ø 选择酶动力强的热启动Taq酶

热启动Taq酶的酶动力与扩增效率有关。一般热启动Taq酶的酶动力越强，PCR扩增的指数增长期越长，“S”型曲线更加典型，荧光信号值更高，而且更适合做多重PCR检测。

Ø 选择灵敏度高的热启动Taq酶

一般来说，热启动Taq酶的扩增效率高，灵敏度就高，但也有不一致的情况。如果要扩增的样本目标基因丰度较低，建议对Taq酶的扩增灵敏度进行检测。最常见的检测方法是将目标基因质粒片段进行倍数梯度稀释，并进行PCR检测，选择检测灵敏度较高的热启动Taq酶。目前国内市场上常用的ABl、Bioline、Starvio的扩增灵敏度都比较高。以Starvio的热启动Taq酶为例，即使基因组DNA低到10 pg也能扩增出目标片段。

图1. StarvioHC热启动Taq酶扩增人IL-2基因，泳道1为 DNA Marker，泳道2约为700 pg人基因组DNA，泳道3-7为 2倍系列稀释后的扩增片段。结果表明，StarvioHC具有特别高的检测灵敏度，即使基因组DNA低到10 pg也能扩增出目标片段。