Cell Metabolism | 细胞代谢机制如何做？代谢顶刊CM的这篇文章也许能给你一些灵感

这篇文章于2023年7月发表于Cell Metabolism（IF=29，Acetate controls endothelial-to-mesenchymal transition），是一篇探讨内皮细胞乳酸代谢调控内皮间质转换的文章，其在代谢方面的验证和对分子机制的探索比较典型，正在做相关研究的同学可以借鉴一下。

研究意义：内皮间质细胞转换（EMT）是血管慢性炎症、动脉粥样硬化、肺动脉高压、移植动脉病以及衰老等过程发生的重要病理生理改变，TGF-β信号通路激活是EMT发生的主要原因。正常情况下，内皮细胞表达低水平的TGF-β受体（ALK5），而炎症因子会促进ALK5表达，激活内皮细胞的TGF-β信号通路，引起EMT发生，而EMT又会促进内皮细胞表达白细胞黏附分子促进白细胞的募集和局部炎症加重EMT。这里作者致力于探究长时间的TGF-β信号通路激活对内皮细胞代谢的影响，以进一步阐明EMT发生的分子机制。大部分正常细胞葡萄糖产生的丙酮酸进入线粒体并在丙酮酸脱氢酶（PDH）作用下被代谢为乙酰辅酶A（Ac-CoA），从而进入TCA循环为细胞供能（图0）。但在内皮细胞中，谷氨酰胺是为TCA循环提供碳的主要物质。由于PDH激酶（PDK）对PDH的磷酸化抑制了内皮细胞线粒体对丙酮酸的分解，从而使内皮细胞的丙酮酸被乳酸脱氢酶（LDH）氢化为乳酸（与癌细胞的葡萄糖代谢类似）。PDK通过磷酸化PDH的E1限速亚基抑制PDH，最近有文章指出，PDH异常激活会产生乳酸而非Ac-CoA，而乳酸是可以自由通过线粒体进入胞浆的[1]。与经典的ATP乳酸裂解酶（ACLY）分解代谢乳酸产生Ac-CoA不同，这种情况下产生的乳酸在ACSS2合酶的作用下被转化为Ac-CoA[2]。那么，EMT过程中内皮细胞是否会采用这种Ac-CoA生成形式呢？

综上，阐明EMT发生发展分子机制对相关病理生理改变具有重要意义，而阐明新报导的PDH-乳酸-ACSS2生Ac-CoA通路是否参与TGF-β介导的EMT及其机制，将为EMT提供新治疗靶点。

研究策略： 这篇文章中，作者以内皮细胞代谢为研究靶点，探究了其在EMT发生发展过程中的具体改变。通过使用通用细胞模型（TGF-β刺激）模拟EMT，然后进行RNA-seq，找到了发生显著改变且与代谢相关的基因。对其相应代谢产物进行分析，找到发生改变的代谢阶段，并对其是否影响EMT进行验证，对其具体分子机制进行阐明，最后在拔高一下其临床价值（诊断/治疗价值）。

研究方法：

1、Metabolic effects of endothelial TGF-β signaling

TGF-β处理原代内皮细胞并进行RNA-seq分析发现，代谢相关基因中葡萄糖转运蛋白编码基因SLC2A1显著增加，而糖酵解和大部分的TCA循环基因显著降低（图1A-D）。葡萄糖吸收和糖酵解途径显著增强（图1E-F）。同位素标记结果显示，虽然TGF-β抑制乳酸/异柠檬酸合成不显著，但它能显著抑制α-酮戊二酸生成和TCA循环（图1G）。进一步研究表明，TGF-β使耗氧率（OCR）显著下降，而胞外酸化率（ECAR）显著增加，这表明图1F是TCA循环被阻滞在异柠檬酸脱氢酶（IDH）阶段，而非谷氨酰胺生成的α-酮戊二酸增加（图1H-I）。因此，EMT抑制内皮细胞TCA循环。

2、TGF-β regulates PDK4 expression and Ac-CoA synthesis

由1可知，TGF-β抑制PDK4表达，因此可能促进PDH介导的Ac-CoA生物合成。敲低PDK4显著抑制PDH磷酸化并上调Ac-CoA（图2A-B）。PDK不同剪切异构体中，PDK4显著促进EMT，PDK3对EMT有一定的促进作用，而PDK1和PDK2对EMT没有影响（图2C-D）。作者在PDK4启动子区找到了四个TGF-β信号通路转录因子SMADs的结合位点（SBEs），ChIP表明TGF-β促进SMAD和SBEs的结合，且过表达持续激活ALK5促进SMAD2磷酸化，抑制PDK4表达（图2E-H）。此外，敲低SMAD4能逆转TGF-β对PDK4表达的抑制作用（图2I）。综上，TGF-β/SMAD信号通路抑制PDK4转录，促进Ac-CoA合成。

3、Increase in endothelial Ac-CoA induces EMT in ACSS2-dependent manner

接下来作者探讨了Ac-CoA对EMT的影响及其来源。敲低PDK4导致EMT（图3A-B）。已知PDH在线粒体里催化Ac-CoA产生，一部分Ac-CoA进入TCA循环，另一部分则通过乳酸穿梭被转运到胞浆，被ACLY催化而生成Ac-CoA。但敲除ACLY对内皮细胞Ac-CoA水平没有影响，表明其它Ac-CoA生成通路主导了内皮细胞的Ac-CoA合成（图3C）。敲低催化乳酸形成Ac-CoA的另一重要酶ACCS2显著抑制TGF-β未处理/处理内皮细胞Ac-CoA的生成，并促进内皮细胞标志物的表达，而过表达ACSS2会促进EMT（图3D-G）。此外，在TGF-β处理时过表达PDK4可以抑制EMT（图3H）。因此，内皮细胞胞浆Ac-CoA的主要来源是由ACSS2而非ACLY所介导，且依赖PDK4的Ac-CoA上调促进EMT发生。

4、Endothelial Ac-CoA is largely derived from acetate, and acetate drives EMT

接下来，作者探讨了内皮细胞Ac-CoA的来源。13C同位素标记实验表明，给内皮细胞培养液补充不同水平被标记过的乳酸会改变其吸收速率，但其合成速率不变，即内皮细胞的乳酸合成有其内源性调控机制（图4A-B）。对13C标记的葡萄糖、谷氨酰胺（内皮细胞TCA碳的重要来源）以及棕榈酸酯进行追踪的结果显示，新合成和释放到培养液的乳酸里有60%来源于葡萄糖，而非线粒体的TCA循环（图4C）。此外，敲除ACLY对乳酸生成没有影响，表明ACLY对内皮细胞EMT没有影响（图4D）。进一步研究发现，乳酸是内皮细胞Ac-CoA的主要来源，且乳酸来源的Ac-CoA主要定位于细胞质（图4E-G）。内皮细胞乳酸向Ac-CoA的转换需要ACSS2的催化，TGF-β处理的内皮细胞其葡萄糖来源乳酸的合成水平增加（图4H-I）。此外，向内皮细胞培养液添加乳酸会导致EMT的发生以及SMAD2/3的核定位（图4J-L）。因此，内皮细胞通过依赖ACCS2的方式促进乳酸和Ac-CoA的生成，从而引起EMT。

5、ACSS2-generated Ac-CoA regulates TGF-β signaling

接下来作者探讨了胞浆Ac-CoA增加引起EMT的机制。由于TGF-β是介导EMT发生的主要信号通路，所以作者检测了ACSS2对SMADs家族成员活性的影响。TGF-β促进SMAD2/3/4的核定位，敲低ACSS2抑制SMAD2/4的核定位（图5A-B）。同时，敲低ACSS2抑制SMAD2/4的乙酰化，而过表达ACSS2则增加SMAD2的乙酰化以及SMA2/3的核定位（图5C-E）。敲低ACSS2抑制TGF-β对ALK5表达的上调，敲低SMAD2/4则能抑制ALK5表达（图5F-H）。TGF-β处理以及敲低PDK4均会增加ALK5乙酰化，而敲低ACSS2抑制其乙酰化（图5I-K）。因此，ACSS2介导的Ac-CoA水平上调会影响SMADs以及ALK5的乙酰化，从而影响其定位、活性以及稳定性。接下来作者进一步探讨了乙酰化影响ALK5蛋白表达的机制。敲低PDK4增加了ALK5蛋白的稳定性，而敲低ACSS2促进ALK5蛋白降解（图5L-M）。使用靶向蛋白降解的主要途径--蛋白酶体和溶酶体途径的抑制剂处理细胞发现，抑制蛋白酶体可以增加ACSS2敲低细胞ALK5蛋白表达的下调，表明发生乙酰化的ALK5通过蛋白酶体途径降解（图5N-O）。接下来，为了找到ALK5被乙酰化的赖氨酸位点，作者将ALK5蛋白的25个赖氨酸位点突变为精氨酸，发现K223、K343、K391和K449是可被乙酰化的位点（图5P）。综上，ACSS2介导的Ac-CoA水平上调通过影响SMADs的乙酰化、活性和定位，以及ALK5的乙酰化和蛋白稳定性，引起EMT。

6、ACSS2 regulates EndMT In vivo

接下来，作者在体内水平验证了内皮细胞乳酸代谢对EMT相关疾病动脉粥样硬化的影响。ACSS2的表达在动脉粥样硬化患者以及小鼠组织中显著上调（图6A-B）。作者构建了Acss2条件敲除小鼠，检测结果显示，敲除ACSS2显著减小动脉粥样硬化斑块面积（图6C）。为验证将ACSS2作为临床治疗动脉粥样硬化靶点的可行性，作者使用纳米颗粒将靶向ACSS2的siRNA注射到动脉粥样硬化小鼠体内，结果显示，注射了siRNA纳米颗粒的小鼠其动脉粥样硬化斑块面积显著减小（图6D）。因此，ACSS2可以作为临床治疗动脉粥样硬化或其它EMT相关疾病的靶点（图6E）。

Take-home message：

这篇文章以经典细胞模型为切入口，在明确了自己想要探究的细胞过程后，对细胞进行相关测序，找到和自己感兴趣细胞过程相关基因，并以此为突破口循序验证，发现了内皮细胞Ac-CoA生成新途径可以促进EMT是本文的亮点。给我们的启示：在做研究时最好有自己成熟的细胞或者动物模型，这样当我们根据文献想到ideas的时候，才能有条不紊的根据成熟的模型设计预实验进行验证。这同时也证明了科研需要专注某一领域“打阵地战”，而非和散兵游勇一样“打游击战”，只有在自己熟悉的“阵地”不断加固工事，我们才能立于不败之地。与此同时，我们也应该看到文章中的一些不太完善的地方，例如作者通过验证ACSS2调控EMT间接说明Ac-CoA对EMT的作用，其实并不是特别直接的证据（最好是和证明乳酸调控EMT一样，直接给内皮细胞补充Ac-CoA）；同时，作者原文Figure S3E用免疫荧光说明ACSS2的rescue作用，并不合理（免疫荧光不适合用于蛋白定量）；最后，文中部分WB的结果存在极高的相似性（尤其是补充数据部分，例如Figure S2A和C的calponin以及GAPDH）。所以，我们可以借鉴文章的研究思路，但是对于文章结论要保持谨慎态度。

【参考文献】

1. Liu, X., et al., Acetate Production from Glucose and Coupling to Mitochondrial Metabolism in Mammals. Cell, 2018. 175(2): p. 502-513 e13.

2. Vysochan, A., et al., ACSS2-mediated acetyl-CoA synthesis from acetate is necessary for human cytomegalovirus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017. 114(8): p. E1528-E1535.