Genome Biology重磅！乳酸化修饰组学揭示视网膜血管生成新机制

景杰生物 | 报道

视网膜中的功能性血管网络对于正常视力至关重要，增殖性血管病变是众多眼部疾病的主要原因，包括早产儿视网膜病变（ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）等。大多数视网膜血管病变是由缺氧引起的，但其潜在机制尚不完全清楚。缺氧状态导致乳酸堆积，乳酸可通过介导蛋白质乳酸化修饰进而影响蛋白功能。因此乳酸化修饰可能参与缺氧诱导的视网膜新生血管形成，但相关研究尚未见报道。

2023年4月21日，重庆医科大学附属第一医院侯胜平教授团队在Genome Biology（IF=18.01）发表了题为“的文章。研究运用4D蛋白质组学及乳酸化修饰组学技术，绘制了小胶质细胞在常氧和缺氧条件下的乳酸化修饰图谱。研究发现缺氧导致小胶质细胞中的转录因子YY1（K183位点）乳酸化增加，诱导FGF2表达，在视网膜新生血管形成中发挥重要作用。靶向乳酸/p300/YY1 乳酸化/FGF2 轴可能为增殖性视网膜病提供新的治疗靶点。景杰生物为该研究提供了4D蛋白质组学、乳酸化修饰组学、乳酸化修饰泛抗体与抗体定制技术支持。

小胶质细胞是中枢神经系统和视网膜中的常驻免疫细胞，在血管生成和血管病变中起着至关重要的作用。视网膜缺氧导致病理性血管生成，小胶质细胞被吸引到该部位，与新形成的血管紧密结合，并充当重要的调节剂。研究人员通过构建的缺氧诱导视网膜病变（Oxygen induce retinopathy, OIR）小鼠模型（图1a），证实小胶质细胞对视网膜新生血管形成至关重要。缺氧导致视网膜小胶质细胞大量增殖并聚集在新生血管形成部位周围（图1b）。使用CSF1R 抑制剂（PLX3397）诱导小胶质细胞消融，可显著抑制病理性新生血管形成（图1c、d）。

图1 小胶质细胞对视网膜新生血管形成至关重要

乳酸化是一种新型的乳酸衍生的翻译后修饰，在多种细胞过程中起着关键作用。研究发现乳酸和乳酸化水平升高与视网膜新生血管形成有关。在网膜病变小鼠的视网膜及视网膜小胶质细胞中，乳酸含量及乳酸化修饰水平皆显著升高（图2a、b、c、d）。随着小胶质细胞的耗竭，视网膜中乳酸化修饰的水平相对下调（图 2e）。糖酵解抑制剂二氯乙酸（DCA）与有氧呼吸抑制剂鱼藤酮（Rotenone）处理，可降低/增加小胶质细胞的乳酸化水平，减轻/加重病理性新生血管形成（图2f、g、h）。

图2 缺氧环境下小胶质细胞乳酸化修饰水平升高促进新生血管形成

为了进一步描述缺氧条件下小胶质细胞乳酸化的特征，研究者使用常氧和缺氧分别处理HMC3 小胶质细胞24小时（样本策略），运用4D蛋白质组学及乳酸化修饰组学技术（质谱策略），绘制了小胶质细胞在常氧和缺氧条件下的乳酸化修饰图谱。研究共鉴定到751个蛋白上3093个乳酸化修饰位点，其中67个蛋白中的77个位点乳酸化修饰水平显著上调（图3a）。乳酸化修饰差异蛋白大多数在细胞核中发挥作用，参与DNA转录过程（图3b、c）。基于修饰组学定量结果，研究人员选择YY1作为重点研究对象，因为其乳酸化修饰水平显著上调（3.56倍），但是其蛋白质表达水平没有差异。且YY1是一种多功能转录因子，被报道参与血管生成的调节。碰撞诱导解离（CID）分析确定了YY1上K183位点发生乳酸化修饰（图3d），通过定制特异性YY1 K183 乳酸化修饰抗体证实缺氧条件下YY1蛋白表达不变，但其乳酸化修饰水平显著增加（图3e）。点突变实验（第183位赖氨酸（K）突变为精氨酸（R），模拟去乳酸化修饰）进一步验证了YY1乳酸化修饰对小胶质细胞促血管生成能力的重要调控作用。K183R突变降低缺氧处理的小胶质细胞中YY1 乳酸化修饰水平，并抑制与之共培养的视网膜微血管内皮细胞血管生成能力（图3f-i）。

图3 小胶质细胞中YY1的乳酸化在调节血管生成中起重要作用

研究进一步确定了YY1K183乳酸化修饰影响小胶质细胞促血管生成能力的分子机制（图4）。结果显示，小胶质细胞中，YY1可直接与经典促血管生成因子FGF2的启动子结合并促进其转录，且这一过程受YY1乳酸化修饰水平调控。此外，YY1K183乳酸化修饰受酰化修饰酶P300调控。缺氧条件下，HMC3小胶质细胞中酰化修饰酶p300表达上升，增加YY1乳酸化修饰水平，并促进FGF2表达，从而促进血管生成。使用P300抑制剂（A485 ）处理，可减少视网膜小胶质细胞的YY1乳酸化并抑制OIR中的血管生成。总之，研究表明阻断糖酵解-P300-YY1乳酸化-FGF2信号转导可能为治疗视网膜新生血管疾病提供治疗范例。

图4 小胶质细胞YY1乳酸化修饰调控内皮细胞血管生成机制示意图

综上所述，小胶质细胞有助于大脑和视网膜中的血管生成。该研究评估了缺氧、乳酸化和小胶质细胞介导的新生血管形成之间的机制联系，将乳酸/p300/YY1乳酸化/FGF2转录轴确定为小胶质细胞促进新血管生成的重要机制的一部分。缺氧条件下，小胶质细胞中乳酸的堆积诱导非组蛋白YY1乳酸化修饰水平增加，YY1 K183位乳酸化激活YY1的转录活性，诱导FGF2转录及表达，进而促进血管生成。这一过程受乳酸化修饰酶P300调控，靶向P300可抑制视网膜新生血管的病理性生成，为视网膜新生血管疾病提供了潜在的治疗靶点。

值得一提的是，乳酸化的发现提高了我们对乳酸的功能及其在各种病理生理条件下的作用的理解。该研究基于“表型分析+质谱发现+生物学验证”的思路探索了乳酸化在血管生成中的作用，也为乳酸化的生物学功能探索提供了范例和启发。如早产儿视网膜病变（ROP）是婴儿视力障碍和失明的主要原因，临床数据表明ROP婴儿的乳酸含量上调，但是否通过上调视网膜小胶质细胞的乳酸化起作用还需要进一步研究。此外，研究发现在小鼠视网膜发育的早期阶段发现了YY1的过度乳酸化。YY1乳酸化水平在后期降低，这表明YY1除了参与视网膜病理性的新生血管生成，也可能在生理血管生成中发挥作用。