标记二抗的选择及应用实例

标记二抗的作用：

　　二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于标记二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot(通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质)，ELISA，免疫组织化学(检测组织中的特异性抗原)，免疫细胞化学(通过免疫学方法检测细胞的抗原组成)，流式细胞术及免疫沉淀(通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原)。

　　二抗针对某一特定物种(如小鼠)的所有抗体均具有特异性，因而使用标记二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用;此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

标记二抗可以耦联有几种不同的标记，可以是酶，荧光素，或生物素。

　　标记二抗的选择：

　　通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：

　　一抗的物种来源

　　一抗是在什么物种来源的，相应的二抗也要是抗该物种的抗体。例如，如果一抗是在小鼠体内制备的，那么你就应当选择抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔体内制备的，那么二抗就应当是抗兔的抗体。至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。

　　一抗是属于哪个类或亚类

　　二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的标记二抗就是抗IgG抗体。单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗体。

　　如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么二抗在双标记实验中尤其适合。

如果你不知道一抗是哪一类别或亚类，那么抗小鼠IgG是一个不错的选择，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

　　标记二抗应用实例分析

　　为分析标记二抗的使用情况，我们随机抽取了100篇2007年或2008年发表于Science 或 Journal of Biological Chemistry杂志上的 文章(英文)，这些文章涵盖了来自于16个国家的约80个研究机构。收集的数据显示二抗的使用非常广泛，可以应用到几乎所有类型的免疫检测中，尤其是Western blot、免疫组织化学和免疫细胞化学。事实上，二抗在ELISA及流式细胞术中应用也很广泛，不仅用于科学研究，而且广泛的应用于临床分析和疾病诊断。比较而言，二抗在免疫沉淀中的应用相对较少。以下内容是基于对所收集的二抗信息进行统计分析后得出的一些结论，对于您在具体的实验中如何选择的抗体具有借鉴作用。

　　选择二抗时，您必须考虑到以下因素，如一抗的物种、产生二抗的宿主、一抗的类别或亚类、二抗所耦联的探针类型及二抗的形式(如整个IgG分子，F (ab’) 2片段，或Fab片段)等等。因此选择哪种类型的二抗很大程度上决定于您所使用的一抗是什么，尤其针对种属和类别而言。通常情况下，一抗可以在山羊、小鼠、兔子、大鼠及绵羊体内制备，其中属小鼠及兔子zui为常见，相应的，标记二抗的种属也应当与一抗的相一致。而对于制备二抗的宿主，则应选择另外一种不同的动物，一般选用驴、山羊、兔子、绵羊或其他较大的动物，可以实现二抗的大规模制备，其中又属山羊使用zui多。

　　对于二抗类别或亚类的选择，应遵循与一抗类别或亚类相一致的原则，其中抗IgG使用zui多。这可能是因为除了五种类别的单克隆抗体外，很多一抗是多克隆抗体，属于IgG类免疫球蛋白。此外anti-IgG可以识别几乎所有类型的IgG亚类，因此，在不清楚一抗是属于那个类别或亚类的时候，anti-IgG抗体是个不错的选择。从我们的数据来看，值得注意的是， IgG亚类特异性的二抗(如抗IgG1，抗IgG2，抗IgG2a，抗IgG2b)通常用于双标记实验中，包括免疫细胞化学、免疫组织化学及流式细胞术。

　　此外，整个IgG分子是zui常用的一种二抗分子形式，而F (ab’) 2片段或Fab片段一般仅用于特殊实验中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况，或需要封闭内源性免疫球蛋白的时候。