目前关于心肌缺血及再灌注损伤（IRI）的病理机制尚不明确。先前已有研究使用 scRNA-seq 对再灌注损伤所涉及的细胞类型复杂的异质性进行探究，但该技术不能保存细胞在组织内的空间信息；另一方面，常规转录组分析无法在单细胞层面上研究蛋白质翻译后修饰。除此之外，如何防止再灌注损伤的发生也是研究中的重要课题。

鉴于此，中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室的王利教授团队利用组织成像质谱流式（Imaging Mass Cytometry, IMC）绘制了单细胞分辨率下 IRI 后小鼠心脏细胞结构以及翻译后修饰的时空图谱，并发现内皮细胞中的H3K9me3是治疗IRI后心脏病理重塑的重要潜在靶点。研究成果“Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury”发表在期刊《Circulation Research》。

01-研究思路和IMC抗体panel

研究人员共选取了小鼠的12个心脏节段，心肌缺血过程的8个时间点，使用包含29个抗体的 panel，其靶标除了细胞分型标志物外，还涵盖了与再灌注损伤相关的激酶通路和甲基化、乙酰化等组蛋白修饰的靶标，获得了251张质谱图像以及识别了197063个单细胞。

图1 研究思路

图2 29个抗体panel详情

02-心肌缺血再灌注的时空单细胞表型分析

通过分型标志物，心脏细胞可被定义为心肌细胞（CM）、内皮细胞（EC）、成纤维细胞（FB）、巨噬细胞（MP）和平滑肌细胞（SMC）等类型。在再灌注损伤三天后，部分区域出现心肌细胞显著损失；同时，相同区域内纤维化程度明显增加。在整个心肌缺血过程中，成纤维细胞与心肌细胞的表现呈相反趋势，这说明纤维化的严重程度与心肌细胞的损失直接相关，同时发现内皮细胞在早期缺血和 IRI 后期病理重塑过程中特定位置出现两次反应性增多，这些观察结果与既往研究报道 IRI 过程已知病理重塑时间一致，表明利用 IMC 技术在 IRI 中检测整个心室壁细胞变化是有效可行的。

图3 IMC确定IRI中的位置和时间依赖性细胞类型改变

03-细胞社区分析

接下来研究人员进行了细胞社区分析，利用细胞间空间位置数据将细胞分成23类不同的群落（CCs）。首先确定了正常心脏左心室的细胞表型，随后比较正常心脏和缺血损伤后心脏的 CCs 的变化，发现损伤后细胞群落快速改变，而梗死区域、边缘区域和遥远区域的变化趋势并不相同。这不仅揭示了再灌注损伤后病理反应的异质性，也再次说明了研究不同解剖位置的重要性。

图4 细胞群落分析揭示了与局部组织结构相关的细胞表型

图5 缺血再灌注损伤后细胞结构的动态变化

04-IRI中的信号通路和表观遗传调控模式

为了揭示 IRI 发病进展过程中的关键信号传导和表观遗传变化，研究人员利用 IMC 的 panel 分析了7种磷酸化蛋白和14种组蛋白翻译后修饰事件。发现激酶信号似乎在梗死的边缘区附近被激活，而组蛋白修饰表现出不一样的修饰模式。接下来应用无监督聚类生成了13个 PTM 表达簇（PTMI），用以进一步确立与时空关联的细胞特异性翻译后修饰特征。PTMI1、PTMI7 和 PTMI10 是 IRI 中期在 Mid 到 Apex 段存在强信号的 PTMI，在这其中 ECs 的比例增加。而在 EC 特定的PTM信号中，发现 PTMI10 中的 H3K9me3 修饰在 ECs 中明显增加，表明 H3K9me3 在 IRI 有关的 ECs 中应激水平增高。

图6  缺血再灌注损伤中的信号通路和表观遗传学调控模式

研究人员随后探究 H3K9me3 在缺血再灌注损伤中的作用，利用缺血再灌注损伤小鼠模型发现抑制 H3K9me3 后的内皮细胞可改善心肌缺血再灌注损伤。并且通过 RNA-seq 及 ChIP-seq，发现 H3K9me3 可直接调控 EC 功能相关基因的表达，从而改善 IRI 的预后。

图7 EC特异性缺失H3K9me3改善缺血再灌注损伤

总结

该研究通过 IMC 充分描绘了 IRI 过程中的翻译和翻译后水平的时空调控图谱，重点阐述了翻译后修饰的单细胞互作网络以及病理重排情况，并在此基础上发现 PTM 调节反应是引起 IRI 病理重塑的重要机制。该研究有望为 IRI 的治疗提供新的重要潜在靶点。

【参考文献】Yao L, He F, Zhao Q, Li D, Fu S, Zhang M, Zhang X, Zhou B, Wang L. Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury. Circ Res. 2023.