文献学习093–Immune Regulation of the Liver Through the PCSK9/CD36 Pathway During HTR

通讯作者：

关于PCSK9
参考：PCSK9: 心血管疾病治疗的明星靶点

1. PCSK9 Ablation Attenuates HTR in Mice

Fig 1a： 甲强龙治疗后，接受了心脏移植的患者外周血PCSK9显著下降
Fig 1b： 接受了同种异型心脏移植 (allogroup, balb/c移给C57) 的小鼠在心脏移植6天后，外周血PCSK9显著高于对照组，包括isogroup组 (C57移给C57)。而isogroup和allogroup小鼠的血脂水平没有显著差别。

Fig 1c, d： Pcsk9 knockout鼠心脏移植后的存活时间显著延长，心脏炎症浸润和心肌损伤减轻。
Fig 1e： RNAseq结果显示编码免疫细胞、转录因子、细胞因子相关的基因在Pcsk9 knockout心脏移植鼠的心脏组织中都下降。
Fig 1f： 在心脏移植后6天，流式分析显示Pcsk9^–/–鼠脾脏IFN-γ–producing CD4⁺和 CD8⁺ 效应T细胞下降，而Treg比例上升。
Fig 1g： ELISPOT结果同样显示Pcsk9 knockout 引起了脾脏 IFN-γ–producing donor-reactive cells 比例的下降。
Fig 1h： 类似的移植物存活情况在Pcsk9单抗Alirocumab (阿莫罗布单抗)中观察到。Alirocumab治疗组移植物存活时间显著长于对照组和statin lovastatin治疗组。
Together, these data indicated that PCSK9 participated in the alloimmune response after heart transplantation.

ELISPOT
ELISPOT（Enzyme-Linked Immuno Spot）是酶联免疫与斑点显色的结合：细胞受到抗原刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被 ELISPOT板底PVDF膜上（预包被的）的特异性单抗捕获。去除细胞后，被捕获的细胞因子与生物素标记的单抗结合，其后再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合。加底物显色后，PVDF 膜上出现的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 ELISPOT Reader对斑点进行计数和分析。统计膜上的斑点数目,再除以当初加入孔内的细胞总数,就可以计算出阳性细胞的百分比。

2. Histological and Multiomics Analyses of Multiple Organs in Recipients During HTR

Fig 2a： 为了寻找心脏移植后升高的PCSK9的来源，作者对心脏移植小鼠的多种脏器包括移植心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏和淋巴结进行了检测。
Fig 2b： qPCR、组化和western结果都显示肝脏的PCSK9显著增高。
Fig 2c： 这些脏器的RNAseq也提示肝脏比其他脏器有着更多的差异基因。
Fig 2d： 肝脏的RNAseq结果显示ALLOGRAFT REJECTION通路被显著富集，同时存在着IFN-r、IL6-JAK-STAT3、TNFA-NFKB 和 P53 信号通路的激活。
Fig 2e： 肝脏的蛋白组也得到了类似的结果。同时，脂肪酸代谢和胆汁酸代谢通路活化增强。
Fig 2f： 作者也做了western的验证
Fig 2g-h： 肝脏代谢组结果也显示多种脂肪酸和胆汁酸出现下调。These data suggested that the fatty acid and bile acid metabolism of the liver was inhibited during HTR.
Thus, we demonstrated the upregulation of PCSK9 expression and differences in inflammatory and metabolism pathways in recipient livers during HTR.

3. Single-Cell RNA-Seq Analysis of the Liver in Mice During HTR

随后作者对isogroup和allogroup小鼠(移植后6天)肝脏进行了单细胞测序，得到7种细胞。差异分析显示在7种细胞中，肝细胞的差异基因最多。通路富集显示肝细胞存在TNFA和IFNG通路的激活，与bulk RNAseq相一致。

4. TNF-α and IFN-γ Synergistically Increase PCSK9 Expression in Hepatocytes Through SREBP2

Fig 4a： 为了探究肝细胞激活炎症通路是HTR后的cytokine storm引起并促进了PCSK9的表达，作者对移植后day6受体鼠血浆进行了multiplex cytokine assay，发现多种促炎细胞因子(eg, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, VCAM-1, and M-CSF) 升高。
Fig 4b： 使用上述升高的细胞因子在体外干预原代肝细胞，发现只有IFN-γ 和TNF-α可以诱导肝细胞表达Pcsk9。
Fig 4c： IFN-γ 和TNF-α刺激肝细胞24h后，培养上清的PCSK9显著升高，联合刺激升高更显著。
Fig 4d： 作者对IFN-γ 和TNF-α刺激的肝细胞进行了RNAseq检测，发现存在158个上调基因和110个下调基因。上调基因富集到了TNFA-NFKB、IFN-r以及胆汁酸代谢通路等。和Figure 2D–2F以及Fig 3c中的结果相一致。
Fig 4e： ❗️随后作者探究了此前报道过的可以调控PCSK9表达的转录因子在转录组中的表达，发现Srebf2 (甾醇调节元件结合蛋白2) 出现最显著的上调。
Fig 4f： qpcr和western验证了联合干预后肝细胞Srebf2的上调。
Fig 4g： 而这个上调可以被选择性阻断 NF-κB (Helenalin) 和 IFN-γ/ STAT1 (Cirsilineol) 通路所抑制。
Fig 4h-i： si掉Srebf2可以阻断IFN-γ 和TNF-α联合刺激下肝细Pcsk9的表达。
Fig 4j-l： 体内实验：作者对WT鼠、Tnf^–/–和Ifn^–/–鼠进行了心脏移植，发现Tnf^–/–和Ifn^–/–鼠的肝脏Srebf2的表达降低，肝脏和外周血的PCSK9也下降。
Fig 4m： Together, these data suggest that TNF-α and IFN-γ synergistically promote PCSK9 expression in hepatocytes through SREBP2.

5. Hepatocyte-Specific Pcsk9 Deficiency Ameliorates HTR in Mice

为了验证前面的结论：肝脏特异性的表达PCSK9调控HTR，作者构建了肝脏特异性PCSK9敲除鼠。
肝脏特异性PCSK9敲除鼠进行心脏移植后存活期显著延长，心脏炎症浸润减少，脾脏 IFN-γ– producing CD4⁺和CD8⁺效应T细胞减少，Treg增加，脾脏IFN-γ–producing donor-reactive cells也减少。
Thus, these results indicate that PCSK9 production by hepatocytes was responsible for allograft rejection after heart transplantation.

6. PCSK9 Influences CD36 Expression and Macrophage Function

Fig 6a： ❗️为了探究HTR过程中PCSK9的促炎作用，作者使用了一个此前报道的排斥和非排斥的移植心脏的心内膜活检micro-array数据。在其中查看了已经报道的PCSK9的target (LDLR, LRP1, LRP5, LRP8, VLDLR, 和 CD36) 的表达。在这些靶点中，只有CD36是显著差异表达的。
Fig 6b： 随后作者对移植心脏进行了单细胞测序，发现CD36主要表达于巨噬细胞。
Fig 6c： 免疫荧光验证心脏巨噬CD36的表达。
Fig 6d： 由于CD36在巨噬细胞的免疫代谢调节中非常重要，而巨噬细胞在适应性免疫和T细胞介导的排斥反应中起到始动作用，作者随后探究了PCSK9对CD36的表达、代谢和巨噬细胞功能的影响。作者将allogeneic BALB/c的脾脏细胞腹腔注射给了C57，同时给一组小鼠注射了PCSK9 (50 μg/mouse)，16小时后，对腹腔巨噬进行了检测。
Fig 6e： 结果显示腹腔巨噬的百分比和吞噬功能没有显著变化(附件)，但其表达MHCII和共刺激分子 (CD80, CD86 和 CD40) 增加。
Fig 6f： 腹腔巨噬的CD36表达和脂肪酸摄取都下降。
随后作者将两组腹腔巨噬和TEa transgenic T细胞（specifically recognize the MHC I-Eα antigen of BALB/c mice）进行了共培养。
Fig 6g： 和PCSK9-treated macrophages共培养24h后的TEa细胞出现显著增强的增殖和IFN-r的产生。
Taken together, these findings suggest that PCSK9 not only controls CD36 expression and fatty acid uptake but also enhances the proinflammatory phenotype and function of macrophages.

7. Protective Effect of PCSK9 Ablation Against HTR Is Dependent on the CD36 Pathway in the Recipient

Fig 7a： 为了探究PCSK9介导的肝细胞和graft-infiltrating macrophages的互作，作者通过流式分析了WT和PCSK9^-/-鼠心脏移植后的graft-infiltrating macrophages。结果显示PCSK9^-/-鼠的巨噬减少，M1型细胞减少，M2型增多。
Fig 7b-c： 此外，CD36的表达在 Ly-6C^low 细胞中比 Ly-6C^high促炎巨噬中更高。 肝脏PCSK9缺乏抑制了Ly-6C^high CD36^low促炎巨噬的分化，促进了巨噬细胞对脂肪酸的摄取。
Fig 7d： UMAP图显示Pcsk9^fl/fl 和 Pcsk9^fl/flAlb-Cre⁺鼠在移植6天后的graft-infiltrating macrophages 分为2群，P1和P2，敲除鼠的P2更高，P1较低。分析显示P1是iNOS^highCD206^low Ly-6C^high CD36^low proinflammatory macrophages 而 P2 是iNOS^lowCD206^high Ly-6C^low CD36^high alternatively activated macrophages.
Fig 7e： 移植6d后，作者分离了两组graft-infiltrating macrophages和TEa细胞共培养了48h。结果显示和Pcsk9^fl/flAlb-Cre⁺鼠巨噬共培养的TEa细胞增殖下降，IFN-r产生下降。
Fig 7f：最后作者在HTR小鼠模型上使用了CD36的中和抗体，发现阻断CD36后，移植心脏存活时间增加，炎症浸润减轻。
Fig 7g： 在CD36^-/-鼠上也得到了一致的结果。

该研究揭示了HTR期间肝脏通过PCSK9/CD36途径进行免疫调节的新机制，该机制影响巨噬细胞的表型和功能，并表明该途径的调节可能是预防HTR的潜在治疗策略。