【研究生】流式细胞术原理、荧光通道、流式图、实验对照设计等_哔哩哔哩_bilibili

流式细胞术需要单个细胞悬液，除了血液、骨髓、淋巴液等是天然单细胞悬液，其它实体组织均需要事先进行消化或物理研磨处理成单个细胞

样本量要求：5x10^5-1x10^7 cells/ml；0.5-1ml；提前300目筛网过滤

1.流式细胞仪组成部分

2.流式细胞仪检测的光信号

①散射光信号：前向角散射光FSC[细胞相对大小]；侧向角散射光SSC[细胞相对颗粒度]

②荧光信号[细胞抗原的表达量]

人外周全血细胞（RBC溶解后）

3.荧光素抗体的选择原则：正确的激光器激发+确定所需探测器（滤光片+PMT）

3种滤光片：LP(长波滤光片)；SP(短波滤光片)；BP(带波滤光片)[eg：图中是500±25]

Beckman Coulter，GALL IOS 

BD FACSCelesta

4.三种类型的流式图

①直方图histogram[单参数分析，纵轴都是count]

②二维点图dot plot[双参数分析]

③等高线图contour plot[双参数分析，分群不是很明显时可辅助应用]

5.常用流式对照

①阴性对照：空白对照[用于去除自发荧光]；同型对照[用来去除自发荧光+非特异荧光]

空白对照可用于调整散射光电压(看到细胞群体)；设定阈值(确定信号阴阳性观测范围)；调整荧光电压(确定阴性细胞位置)

同型对照抗体的选择有严格要求(相同种属来源、免疫球蛋白及亚型、荧光素标记、剂量与浓度、由未免疫动物血清纯化而来)，一般可以去官网查询

②单阳性对照

6.补偿模型[FITC-PE双染举例]

荧光素的发射光谱重叠

荧光补偿compensation：在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠(spectral overlap)的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号【eg：上图就要从被检测的PE信号中去除FITC的干扰信号】

N色分析需要如图设置N个单阳对照管

简而言之：拉到横平竖直

PE中Unl与FITC的medium值要接近才可以