单细胞测序实验流程简要

单细胞从2009年开始实现高通量起，截至目前，应用领域已经扩展到各个方面。除了肿瘤研究外，还包括类器官研究，药物筛选等多领域，同时除了哺乳动物外，还包括了植物方面，也开启了更为广泛的研究。

首先进行单细胞的第一步就是制备高活性的细胞，来源可以是动植物，不过目前哺乳动物研究更为广泛。就哺乳动物来说，可以从离体的新鲜组织中获取细胞，也可以从冻存的组织中获取细胞核。获取到的新鲜细胞通过有效计数进行后续的单细胞实验，获取到的细胞核仍然通过有效的计数进行单细胞核实验。

ps：获取新鲜细胞的方法就是通过对新鲜的组织进行解离，目前市场有有许多已经成熟的解离试剂可以用于解离，通过搭配解离仪器解放双手。也有一些组织需要专门的解离试剂来进行定向解离。所以有时候搭配解离仪器进行解离，不一定是仪器解离的问题，很可能是解离试剂与组织匹配度不高。也跟组织有关系，比如组织的保存条件，环境（比如临床手术样本，由于病人的组织坏死程度及切除位置不一样，都会影响解离的效果）

接下来第二步，开始进行正式的单细胞实验。目前市场上已有多种单细胞平台，从开始的低通量到高通量，发展迅猛。国外目前主流的有10XGenomics 和BD Biosciences。国内的领头羊像新格元生物科技和近期活动较为频繁的墨卓生物也都是围绕单细胞技术开展。

第二步的实验环节包括在仪器上完成RNA捕获，微流控体系中，通过油滴包裹的方式，将细胞、带有UMI和Barcode的凝胶珠以及RT试剂混在一起完成捕获过程。而微孔芯片的原理则是通过物理沉降的方式，使细胞及带有barcode的磁珠沉降至单孔内，在单孔内完成捕获环节。

第三步的实验环节是完成逆转录至cDNA,再PCR扩增至双链，经过适当的磁珠纯化，完成。待进行建库环节。

第四步的实验环节是完成建库，建库部分各家的单细胞试剂盒产品不尽相同，既是通过加Adaptor的方式对目标片段进行处理，再通过连接sample index 完成。

以上，就单细胞转录组实验部分举例，整个实验过程。其中的两个质检环节，一个是在反转录成cDNA后扩增至双链经过纯化后对目标片段进行片段大小及浓度的可视化检测，来判断目标片段是否在合格范围区间；第二个质控环节是在建库完成后，在样本进行二代上机测序前，对目标片段进行检测，看是否在合格范围内的大小机浓度。

Single Cell Gene Expression - Official 10x Genomics Support

GEXSCOPE®单细胞测序试剂盒-新格元生物科技 (singleronbio.com)

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