Cel Che Bio | AOH1996，只作用于癌细胞的特效药，突破还是噱头？

这篇文章于2023年8月发表于Cell Chemical Biology（IF=8.6，Small molecule targeting of transcription-replication conflict for selective chemotherapy），是最近网上热议的特异性抗肿瘤“神药”原文（by希望之城贝克曼研究所）。文章对小分子化合物的药代动力学评估以及一些DNA损伤的检测方法值得借鉴学习。至于该药是否真的可以特异性杀伤肿瘤细胞并治疗癌症，大家见仁见智。

研究意义：DNA复制压力（DNA replication stress）指DNA复制的延缓、抑制或者异常终止，会引起DNA损伤和基因组不稳定。癌细胞因缺乏保护/修复复制叉的蛋白，以及持续激活的增殖信号通路，表现出明显的DNA复制压力【1】。增殖细胞核抗原（PCNA）是重要的肿瘤进展标志物，对DNA复制和修复非常重要（图0）。三个PCNA分子形成环绕DNA分子的环状结构，为DNA聚合酶等DNA结合蛋白提供结合DNA分子的平台。作者之前的研究发现，肿瘤细胞特异表达ca-PCNA，随后设计了靶向该异构体的小分子化合物AOH1160【2,3】。AOH1160能显著抑制肿瘤生长，但由于代谢等参数不佳无法进入临床试验，于是作者设计了新的靶向ca-PCNA的化合物AOH1996。本文便是对AOH1996的药代动力学、毒副作用和治疗肿瘤效果的评估，以及对其作用机制的探索。

图0

研究策略： 本文主要是根据前期发现的肿瘤较特异的标志物ca-PCNA和设计的化合物AOH1160为背景，进一步对该化合物进行优化，以找到代谢稳定稳定，适合临床使用的化合物。这里作者找到AOH1996之后，在体内和体外对其药代动力学和肿瘤抑制效果进行了评估，然后对其作用机制进行了探讨。

研究方法：

1. Superior therapeutic properties of AOH1996

作者检测了AOH1996对作用的特异性。AOH1996显著抑制70多种癌细胞的生长，但对正常细胞影响较小（图1A-C，人外周血单核细胞PBMCs、气道上皮细胞hSEAC和神经嵴干细胞7SM0032）。对其作用机制进行初步探究发现，AOH1996是促进肿瘤细胞的DNA损伤抑制肿瘤生长（图1D）。此外，AOH1996特异性将肿瘤细胞阻滞在G2/M和S期、促进其凋亡并增强顺铂和拓扑替康等抗癌药物的抑制效果，但对正常细胞无显著影响（图1E-H）。

图1

接着，作者对AOH1996的药代动力学进行检测。小鼠体内结果显示，AOH1996半衰期、最高血药浓度以及AUC（评价药物吸收入血情况）相较于AOH1160显著增加（图2A）。实验犬的结果与小鼠结果相似（图2B）。所以，AOH1996具有口服活性，可作为临床试验备选药。接下来作者评估了AOH1996治疗肿瘤的潜力。每日给予小鼠AOH1996能显著抑制肿瘤进展，且对小鼠体重无显著影响（图2C-F）。此外，作者也以美国FDA标准检测了AOH1996的药物毒性作用，结果显示无明显毒副作用，且安全剂量能提高至6倍于有效剂量水平。对DNA损伤进行检测发现，只有AOH1996处理小鼠的肿瘤组织有γH2A.X和磷酸化ChK1表达（DNA损伤标志），且其周围常见被破坏的细胞（图2G）。因此，AOH1996在体内水平引起了DNA损伤和细胞凋亡。接下来，作者探究了AOH1996对患肿瘤小鼠生存情况的影响。口服AOH1996虽然一定程度上促进小鼠存活，但无统计学差异。单用CTP11（拓扑酶I抑制剂，抗肿瘤药）或将CPT11与AOH1996联合用药，显著提高小鼠生存率（图2H）。因此，虽然AOH1996在体内和体外水平能特异性作用于肿瘤细胞并抑制其生长，且具有较好的口服活性，但单独使用对实验动物的存活情况影响不大。

图2

2. Modulating PCNA’s interaction with the transcription machinery

作者进一步探讨了AOH1996的作用机制。免疫共沉淀和质谱结果显示，AOH1996显著改变了结合染色质PCNA与蛋白的互作，大部分发生改变的蛋白是调节转录的蛋白（图3A）。这些蛋白里，组成RNA聚合酶II的亚单位，RPB1和POL2B是唯二含有PCNA结合位点（APIM motif）的蛋白。AOH1996增强PCNA与RPB1的互作，同时降低RPB1蛋白水平。相反，用可以阻断PCNA结合位点的多肽处理细胞可阻滞PCNA和RBP1的结合，并使RPB1蛋白水平升高（图3B-C）。将RPB1的PCNA结合位点氨基酸突变，PCNA和RPB1互作显著减少， RPB1蛋白水平增加，进一步研究表明，PCNA和RPB1相互作用促进了RPB1的蛋白酶体降解（图3D-E）。用CRISPR/Cas9构建结合位点突变的RPB1细胞株并用AOH1996处理，突变肿瘤细胞对处理敏感性显著下降，且质谱GO结果显示，AOH1996引起的多数改变在WT细胞里更为明显（图3F-G）。因此，AOH1996通过促进PCNA和RPB1结合抑制肿瘤细胞功能。

图3

3. Transcription dependent dissociation of PCNA from chromatin

PCNA和DNA复制密切相关，于是作者探讨了PCNA和RPB1结合对DNA复制的影响。AOH1996促使PCNA从常染色质区的解离，但不影响异染色质区的PCNA（图4A）。因此，AOH1996特异性破坏转录活跃区的DNA复制。检测AOH1996对DNA复制叉延伸速度的影响显示，AOH1996显著抑制其延伸（图4B，红色链的长度显示其延伸情况）。DNA损伤检测结果显示，AOH1996会诱发RPB1突变细胞株发生更严重的DNA损伤，抑制转录可以缓解这种损伤（图4C-D）。转录-复制冲突（TRC）是引起DNA损伤和基因组不稳定的重要原因，常见于肿瘤，是肿瘤治疗的潜在靶点【4】。AH1996处理增加了肿瘤细胞的R-loops（促进DNA损伤和基因组不稳定），过表达RNA酶H1则能降低R-loop和DNA损伤，表明AOH1996通过促进R-loop形成引起DNA损伤，从而抑制肿瘤生长（图4E-F）。

图4

Take-home message：

这篇文章是作者继前期发现ca-PCNA并设计相应靶向小分子AOH1160后的又一篇延续性工作（课题的延续性和系统性还是比较值得学习的），主要是对AOH1160代谢不稳定进行优化，找到了具有口服活性且毒性低的新药物AOH1996。虽然AOH1996在细胞实验表现出较好的肿瘤特异性，且能在体内抑制肿瘤生长，但却不影响肿瘤模型小鼠的生存率（图2H），那么这个药的主要优势就是其肿瘤靶向特异性，但仅仅是由此导致的对增殖不旺盛细胞毒副作用小，对患者生存可能没有太大用处（如果能加入更加经典的抗癌药对比可能得出更加明确的结论）。此外，PCNA在增殖细胞里高表达，作者正常组织选用PBMCs（干细胞少，多是成熟的血细胞）和hSEAC这类分化成熟的体细胞作为对照的逻辑有待商榷，且作者的结果显示，AOH1996并非完全对正常细胞没有影响（图1B-C）。

所以，你还认为这款肿瘤“特效药”有媒体报道的那么神奇吗？欢迎大家留言讨论。

【参考文献】

1．Ubhi, T. et al. Exploiting DNA Replication Stress for Cancer Treatment. Cancer Research 79, 1730, doi:10.1158/0008-5472.CAN-18-3631 %J Cancer Research (2019).

2．Gu, L. et al. The Anticancer Activity of a First-in-class Small-molecule Targeting PCNA. Clinical Cancer Research 24, 6053, doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-0592 (2018).

3．Malkas, L. H. et al. A cancer-associated PCNA expressed in breast cancer has implications as a potential biomarker. PNAS 103, 19472, doi:doi:10.1073/pnas.0604614103 (2006).

4．García-Muse, T. et al. Transcription–replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nature Reviews Molecular Cell Biology 17, 553, doi:10.1038/nrm.2016.88 (2016).