鱼类生殖过程极其敏感，容易受到如温度、pH值等环境因素的影响。目前有研究表明，重金属会破坏鱼类的生殖系统，致使鱼类的下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴等多个方面发生失调。黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）俗称昂刺鱼等，是我国特色优质淡水经济鱼类，具有生长速度较快、味道鲜美、营养价值高和无肌间刺等优点，深受广大消费者欢迎。水体中过量的铜不仅会造成该鱼生殖毒性，降低黄颡鱼的生殖力，而且会造成其种质资源衰退，从而严重限制黄颡鱼繁养殖产业的健康发展。因此，本文研究了Cu-NPs对黄颡鱼的生殖毒性，并将其与Cu离子产生的毒性进行了比较。

2023年5月，南京师范大学尹绍武课题组在J Hazard Mater期刊上（IF=13.6）发表了题为“Exposure to copper nanoparticles or copper sulfate dysregulated the hypothalamic-pituitary-gonadal axis, gonadal histology, and metabolites in Pelteobagrus fulvidraco”的文章，该研究通过组织学和超微结构观察、凋亡水平评估、HPG轴基因表达、血清类固醇激素浓度及性腺代谢组分析，揭示了Cu对黄颡鱼的生殖毒性，也为了解Cu-NPs和CuSO4对鱼类的生殖毒性提供了理论基础，。

研究思路

研究结果

1. 铜暴露下生长指数变化及组织中的铜积累

在暴露42天后，不同处理组中黄颡鱼的Body Weight（BW）和Gonadosomatic Index (GSI) 值均有所下降。对雌性和雄性黄颡鱼的大脑、肝脏和性腺中铜元素的浓度检测，结果发现暴露于CuSO4和Cu-NPs可增加雌性和雄性黄颡鱼不同组织中的铜积累（图1）。

图1 雌性(A)和雄性(B)黄颡鱼组织中铜的积累情况

2. Cu-NPs和CuSO4暴露后性腺组织学变化

除初级卵母细胞（PG）和卵黄发生前（PV）卵母细胞外，可在雌性对照组中观察到卵黄发育阶段（vitellogenic stage）的卵母细胞，但100 μg Cu/L Cu-NPs组中发生卵黄堆积的卵母细胞数量低于对照组。经Cu处理后PG时期的卵母细胞比例显著增加。在100 μg Cu/L 的Cu-NPs和CuSO4组中，PV比值也显著降低（图2A、B）。200 μg Cu/L CuNPs组中，PV期卵泡中可见卵泡颗粒细胞增生（图2A）。Cu-NPs和CuSO4处理后，精巢发育和精子发生均受到抑制（图2C）。与对照组相比，200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/L CuSO4组中，精小管中出现大量腔隙，精子分布稀疏，精小管中的成熟精子比例显著降低（图2D、E）。上述结果表明，经Cu-NPs和CuSO4处理后，卵泡发生和精子发生均受到抑制。

图2 黄颡鱼卵巢（A-B）和精巢（C-E）的组织学及统计学分析

超微结构分析显示，对照组雌鱼的滤泡细胞（granulosa cell与theca cells）和微绒毛结构正常（图3A)；而Cu-NPs组中，颗粒细胞和膜细胞存在Cu-NPs积累，且其积累处颗粒细胞附近出现线粒体和囊泡结构损伤（图3B、C）。200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/LCuSO4组的卵泡的颗粒层明显变薄（图3C、D）。在雄鱼中，间质细胞和精母细胞的细胞质中均检测到Cu-NPs积累；内质网（ER）中Cu-NPs的积累，破坏其本身结构的同时形成自噬空泡（图3F)。在200 μg Cu/L Cu-NPs组，精母细胞的胞质中含有缺乏嵴以及退化的线粒体（图3G）。CuSO4处理组与对照组相比，间质细胞出现囊泡，挤压核膜，破坏内质网的结构（图3E）；且所有处理组中均发现精巢基底板的组织紊乱（图3G、H）。

图3 黄颡鱼铜暴露后性腺超微结构的透射电镜（TEM）分析

3. 精巢和卵巢的细胞凋亡信号升高

TUNEL染色显示，暴露于200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/LCuSO4后，卵巢和精巢的凋亡信号增强。在200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/LCuSO4组雌鱼的卵母细胞周围的间质细胞和卵泡细胞中观察到TUNEL阳性信号（图4A）；在雄性的200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/L CuSO4处理组中，明显出现凋亡信号（图4B）。检测性腺细胞凋亡相关的基因发现，在卵巢中，200 μg Cu/L Cu-NPs组和100 μg Cu/L CuSO4组的 bcl2 基因表达显著降低；而卵巢和精巢中，p53 的表达量和 bax/bcl2 的比值显著增加（图4C、D）。

图4 Cu-NPs 和CuSO4暴露后黄颡鱼性腺细胞凋亡水平升高

4. 类固醇激素的浓度和HPG轴基因的表达

在暴露于Cu-NPs或CuSO4的雌鱼中，血清E2水平均显著降低。HPG轴相关基因检测发现，在200 μg Cu-NPs和100 μg Cu/L CuSO4组中，VTG的浓度显著下调。卵巢和精巢的整体表达模式相似，200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/L CuSO4均导致HPG轴基因变化明显。在雌鱼中，200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/L CuSO4组脑中gnrh1的表达显著降低。所有组中，垂体的fshb表达均显著降低。100 μg Cu/L CuSO4组垂体中仅gh的表达被下调。100 μg Cu/L CuSO4组fshr, lhcgr, cyp19a1a, esr1, esr2, foxl2 及 gdf9 等卵巢基因显著下调，而200 μg Cu/L Cu-NPs组lhcgr、esr1和gdf9的表达下调（图5A、B、C）。

在雄鱼中，各处理组的血清T浓度及11-KT浓度均显著降低（图5D、E）。Cu-NPs和CuSO4暴露后，大脑中必需生殖基因的表达没有明显变化。在垂体水平上，100 μg Cu/ L CuSO4组中fshb、lhb、gh 的表达变化显著。在200 μg Cu/L Cu-NPs和100 μg Cu/L CuSO4两种处理下，精巢基因 ar 和 cyp11b2 的表达均显著降低（图5F）。

图5 Cu暴露下黄颡鱼的性类固醇激素水平和下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴基因的表达

5. 暴露于Cu-NPs和CuSO4的性腺组织的代谢物分析

通过代谢组学分析，共鉴定到1399种代谢物。PCA分析发现四组黄颡鱼的卵巢和精巢存在显著差异（图6A、B），也说明暴露于Cu-NPs和CuSO4会导致黄颡鱼性腺的代谢改变。在卵巢中，所有差异代谢物（DMs）的热图显示F0与FN1、FN2与FC1（分别依次对应不同分组）模式的相似性；在精巢中也类似（图6C、D）。为了进一步分析Cu-NPs和CuSO4的生殖毒性，绘制处理组两两比较的维恩图，卵巢组和精巢组中分别获得了20个和39个DMs，它们对不同浓度和形式的铜敏感，并可能作为黄颡鱼性腺中铜暴露的生物标志物（图6E、F）。KEGG富集分析发现，Cu-NPs暴露后雌鱼的差异代谢物在鞘脂和亚油酸代谢途径中显著富集，雄鱼的差异代谢物主要富集在氨基酸、辅酶a和泛酸的生物合成途径（图7A、C）；而CuSO4处理差异代谢物则分别富集在坏血酸和醛酸盐代谢途径及氧化磷酸化途径（图7B、D）。Cu-NPs和CuSO4诱导的黄颡鱼性腺代谢变化，包括性腺类固醇生成、氨基酸代谢、三羧酸（TCA）循环、尿素循环和重要的中间代谢产物（图8）。

图6 铜暴露后黄颡鱼性腺的代谢组分析

图7 差异代谢物的KEGG富集分析

图8 Cu暴露对黄颡鱼代谢产物的性腺代谢途径分析

研究结论

本研究通过组织学和超微结构观察、凋亡水平评估、HPG轴基因表达、血清类固醇激素浓度及性腺代谢组分析证明了Cu胁迫会造成生殖缺陷，抑制卵泡和精子发生并导致性腺凋亡信号增强，影响性腺雌二醇表达水平。这些发现结果揭示了Cu-NPs和硫酸铜对黄颡鱼HPG轴和性腺代谢的毒理学影响。该研究也为为铜诱导的生殖毒性提供了见解，并提高了对纳米颗粒毒性的理解。

本文采用的液相质谱联用的非靶向代谢组学（LC-MS）方法无偏向性、高通量地对Cu胁迫下黄颡鱼性腺组织进行了代谢物检测，通过代谢分析揭示了Cu胁迫下性腺雌二醇的表达水平的变化以及不同的代谢途径对黄颡鱼生殖毒性的调控。诺禾致源经过多年的经验积累以及不断地技术更新，非靶技术组学可提供针对不同样本类型的检测服务，严格把控检出结果，部分鱼类研究的项目经验展示如下：