核酸提取纯化小知识

核酸抽提和纯化是分子生物学试验的基础，核酸纯化方法是影响提取核酸质量高低的最重要因素，也是下游分子生物学试验成败的关键。

一、提取核酸的原因：

①为了分析基础研究和疾病研究中的基因表达；

②跟踪对药物治疗的反应（例如，在抗病毒治疗期间和之后监测病毒滴度）。

③识别新物种并深入了解进化过程（例如，Ancient DNA分析）。

④对人类、动物和植物中引起传染病暴发的病原体进行监测和分类。

⑤通过微生物检测和量化监测食品和水安全。

⑥诊断疾病（如基因疾病，癌症，免疫学缺陷）。

二、核酸提取纯化原则和要求

1、保证核酸一级结构的完整性

2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）

3、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子

4、尽可能降低蛋白质、多糖和脂类等大分子物质

三、核酸纯化的方法及原理如下：

　　1、PC抽提法 

　　PC 抽提是去除蛋白质有效的手段，但超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可去除。且每次抽提都会损失部分核酸。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，某些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸必定降解。PC抽提最大的优势是成本低廉，对实验条件要求较低，对于经费紧张的实验室较为实用。 

　　2、高盐沉淀法

　　高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松的去除蛋白质所可以用于大规模抽提，但其不足之处是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定，蛋白质的沉淀效率在4℃会更好一些。

　3、离心柱法 

离心柱纯化法，是目前试剂盒提取广泛应用的方法。其最大特点是受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高(虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子是完全分开的，所以洗涤更彻底。其致命弱点是样品过量，提取效率较低，且需要反复离心，操作复杂，成本也较高。

离心柱法机理

　4、生物磁珠法 

生物磁珠法是将纯化介质包被在纳米级生物磁珠表面，通过介质对核酸的吸附，在外加磁场下使核酸附着于磁珠定向移动，从而达到固液分离纯化的作用。与其他几种方法相比，生物磁珠法具有很多的优势，

如：①提取灵敏度高(微量材料即可提取)

　　②纯化纯度高(*与蛋白盐等杂质分离)

       ③提取产量高(每mg磁珠能吸附500ug DNA)

误区;

①磁珠使用的越多，提取效果越好——过多的磁珠将无法均匀的分散在液体中，从而丧失其分散的特性，在洗涤过程中也无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率，此外过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中其主要作用的功能成分，导致整个试剂盒的效率低下

②试剂使用的越多，提取效果越好——每增加一部分液体体积，就会减少更多磁珠碰撞的几率，这也意味着吸附率的大幅度下降

③洗涤次数越多，提取效果越好——每次的洗涤都会损失一定量的核酸，并且增加了核酸断裂水解的可能性，一般控制洗涤次数在2~4次最为合适

④样本取用的越多，提取效果越好——建议先处理经过富集或者浓缩步骤再进行提取，或者增加裂解的完全性

⑤某一种磁珠好，就应该在所有实验中效果都好——磁珠和试剂体系都要一定时间的配合调整

⑥和某一种试剂盒相比不好，就是磁珠不好——不同磁珠适合的体系和用量是不同的，往往需要调整后才能获得好效果。

磁珠法机理

5、苯酚氯仿法抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解核蛋白，使DNA从核蛋白中游离出来。而DNA易溶于水，却不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，将枪头伸入不同液层内抽取所需的成分，经多次洗涤后获得纯化核酸。